川芎生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用

刘　絮，姜秀文，王立英，申旭鹏

（北华大学基础医学院，吉林吉林　132013）

川芎生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用

刘絮，姜秀文，王立英，申旭鹏

（北华大学基础医学院，吉林吉林132013）

目的探讨川芎（CHX）生物碱对大鼠脑缺血-再灌注（I/R）损伤的保护作用.方法取Wistar大鼠60只，随机分成6组，每组10只，即假手术组、I/R模型组、川芎生物碱低中高剂量治疗组和阳性药葛根素（GGS）组.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉可逆性脑I/R病理损伤模型，用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸显色法测定脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量.动物苏醒后进行神经功能损伤评分，检测脑组织含水量及容积的变化，同时与假手术组进行比较.结果I/R实验组与注射生理盐水假手术组比较，脑组织中SOD的活性显著降低，MDA的含量明显增加（P＜0.01），脑梗死面积和容积明显增大（P＜0.01），脑组织含水量增多，神经功能损伤较重（P＜0.05）.CHX生物碱治疗组与I/R组比较，脑组织中的SOD的活性显著升高（P＜0.01），MDA的含量明显降低（P＜0.05），脑组织含水量减少，脑梗死容积明显缩小（P＜0.01），神经功能损伤评分差异显著（P ＜0.01）.结论CHX生物碱可减轻大鼠脑I/R引发的脑损伤程度，从而对脑组织具有一定的保护作用.

川芎生物碱；超氧化物歧化酶；丙二醛；脑梗死；缺血再灌注

【引用格式】刘絮，姜秀文，王立英，等.川芎生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）:339-343.

川芎生物碱是从传统中药川芎中提取的具有较强生物活性的大分子化合物，川芎为伞形科多年生草本植物干燥的根茎，其原产于日本、朝鲜及韩国，在中国的吉林省延边有栽培［1］，是常用的中药材，其味辛性温，气浓厚，具有活血化瘀、疏肝解郁、散风止痛的功效，常用于风寒头痛、风湿痹痛、月经不调、瘀滞腹痛、肝气郁结、痈疽肿痛的治疗及扩张脑血管、改善体内微循环及抑制血小板的聚集等作用［2］.川芎生物碱对脑缺血-再灌注损伤的保护作用已引起人们的高度重视.本文主要探讨川芎生物碱对脑I/R损伤的影响，进而证实对大鼠脑I/R损伤具有保护作用，为在临床上防治脑缺血性损伤提供可靠的理论依据.

1　材料与方法

1.1动物

选择健康Wistar大鼠60只，清洁级，雌雄各半，体质量250～300 g，雌雄兼用，由北华大学基础医学院实验动物中心提供，编号为SCXK-（吉）: 2003-2004.

1.2药品与试剂

川芎生物碱的制备:北华大学中药研究室制备，纯度为98%，实验时将其调配至所需要的浓度. SOD试剂盒（批号:20080414）、MDA试剂盒（批号:20080416）（南京建成生物制药厂）；水合氯醛（批号:20070613）（上海五联化工厂）；鱼线（日本PATU公司），直径为0.26mm.

1.3仪器

冷冻离心机（3K30，Sigma公司）；7200紫外分光光度计（上海仪器有限公司）；玻璃匀浆器（上海仪器厂）.

1.4实验分组及给药

实验中将动物随机分成I/R模型组、假手术组、川芎碱生物碱高中低剂量组和对照阳性药GGS组，每组10只.1）I/R模型组，腹腔注射生理盐水10m L/kg，连续7 d，1次/d；2）I/R+CHX 50 mg/kg组，CHX生物碱50 mg/kg，连续7 d，1次/d；3）I/R+ CHX 100mg/kg组，CHX生物碱100mg/kg，连续7 d，1次/d；4）I/R+CHX 200mg/kg，CHX生物碱200 mg/kg，连续7 d，1次/d；5）假手术组，先常规进行手术，但并未制造大鼠脑局部I/R损伤病理模型；6）阳性药GGS（5mg/kg）对照组，每天行1次的腹腔注射GGS（5mg/kg），连续7 d.各组腹腔注射药物7 d后制造局灶性大鼠脑I/R病理损伤模型（除假手术组外）.

1.5大鼠脑I/R损伤模型制作

实验中利用改良的Longa法［3-6］制作大鼠脑I/R损伤模型:手术前大鼠禁食12 h，但不禁水.用10%的水合氯醛（0.36mL/100 g）腹腔注射麻醉，大鼠麻醉后仰卧位固定，行颈正中做切口，分离暴露大鼠右侧的颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA），用0-3号的鱼丝线分别结扎ECA和CCA远心端，用微型血管夹夹紧ICA，在CCA近心端处剪一小口，用事先准备的头端烧制圆钝鱼线沿CCA走行插入ICA，约插入鱼线的长度为18.5～20 mm后明显有阻力时停止进线，后结扎ICA，并固定鱼线，依次缝合肌肉及皮肤，颈外留有2 cm的鱼线以备再灌注.鼠脑缺血3 h后，用手轻轻拔出鱼线至遇有轻微阻力时，再灌注2 h之后剪去体外留有的鱼线，待大鼠完全苏醒之后行大鼠神经行为学的评分.术中及术后注意保持体温，室温保持在20～24℃.

1.6大鼠神经行为评分

大鼠脑缺血3 h再灌注2 h后，由一名不参与实验的观察者评估记录大鼠神经行为学评分.参考Iea-longa等［7］报道的7级评分方法进行评级.0级:无异常；0.5级:竖毛、轻度运动低下；1.0级:前肢屈曲、运动障碍；2.0级:行动不协调、屈取姿势、旋转运动；3.0级:偏瘫、不能站立和行走；4.0级:痉挛、昏睡；5.0级:死亡.1～4级符合实验要求，剔除不符合实验要求的大鼠并加以补充.

1.7大鼠脑组织含水量、MDA含量及SOD活性的测定

大鼠脑缺血3 h后再灌2 h，分批次处死大鼠并迅速取脑，取鼠右半脑的二分之一用于测量脑组织含水量的变化，称湿重后置于100℃烘箱内至恒重.脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%.

脑的另二分之一作脑组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶方法检测鼠脑组织中的SOD活性；用硫代巴比妥酸显色法测定脑组织中MDA的含量.

1.8统计学方法

应用SPSS 19.0软件统计进行统计，数据用均数±标准差±s）来表示，组间差异行方差分析，两两比较用SNK-q检验.

2　结　果

2.1CHX生物碱对大鼠脑组织中SOD活性和MDA含量的影响

应用试剂盒检测结果表明:I/R组大鼠脑组织中SOD的活性明显低于假手术组（P＜0.01），MDA的含量明显高于假手术组（P＜0.05）；经CHX（50，100，200mg/kg）作用7 d后，SOD的活性显著升高，MDA的含量明显降低，与I/R模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.CHX生物碱能显著提高大鼠I/R损伤时鼠脑组织中的SOD活性，并降低鼠脑组织中的MDA含量.见表1.

表1　CHX生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤脑组织中SOD活性及MDA含量影响Tab.1　Effects of CHX Alkaloids on SOD activity and MDA content in I/R injury of rats’brain （n=10，±s）

表1　CHX生物碱对大鼠脑缺血-再灌注损伤脑组织中SOD活性及MDA含量影响Tab.1　Effects of CHX Alkaloids on SOD activity and MDA content in I/R injury of rats’brain （n=10，±s）

注:与假手术组比较，**:P＜0.01；与I/R比较，▲▲:P＜0.01，▲:P＜0.05；**:P＜0.01；与GGS比较，▲▲:P＜0.01，▲:P＜0.05

组别　ω（剂量）/（mg·kg-1）　脑组织匀浆液λ（SOD）/（U·mg-1）　c（MDA）/（nmol·L-1）假手术组　—　39.18±2.15　6.80±0.83 I/R　10mL/kg　18.53±2.08**　7.07±1.16**I/R+CHX（低）　50　10.14±1.82　4.46±1.42 I/R+CHX（中）　100　26.50±2.20▲▲　8.38±1.38▲▲I/R+CHX（高）　200　21.07±1.88▲　5.92±1.08▲GGS　5　23.40±1.20　7.38±1.38

2.2CHX生物碱对缺血再灌注大鼠脑组织含水量的影响

缺血3 h再灌注2 h后，I/R组大鼠脑含水量较假手术组明显增高（P＜0.05）.实验前经CHX（50，100，200mg/kg）作用7 d后，脑组织含水量降低，与I/R组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）.可见川芎生物碱能降低I/R大鼠脑组织的含水量，对脑组织具有一定的保护作用.各用药组间比较结果差异无统计学意义.见表2.

表2　CHX生物碱对缺血再灌注大鼠脑组织含水量的影响Tab.2　Effect of CHX A lkaloids on water content of brain tissue in I/R rats　（n=10，±s）

表2　CHX生物碱对缺血再灌注大鼠脑组织含水量的影响Tab.2　Effect of CHX A lkaloids on water content of brain tissue in I/R rats　（n=10，±s）

注:与假手术组比较，**:P＜0.01；与I/R比较，▲▲:P＜0.05；**:P＜0.01；与GGS比较，▲▲:P＜0.05

组别　ω（剂量）/（mg·kg-1）　脑组织含水量/mg假手术组　—　761.3±10.8 I/R　10mL/kg　789.7±8.1** I/R+CHX（低）　50　778.4±7.4 I/R+CHX（中）　100　762.3±6.4▲▲I/R+CHX（高）　200　769.9±8.6 GGS　5　764.8±7.3

2.3CHX生物碱对大鼠脑I/R损伤后的神经功能影响

各给药组大鼠脑I/R后神经功能损伤的评分与单纯I/R组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；各用药组间比较差异无统计学意义.见表3.

表3　CHX生物碱对大鼠脑缺血3h再灌注2h后神经功能的影响Tab.3　Effect of CHX A lkaloids on nerve function after 3 hours of ischem ia followed by reperfusion 2 h in each group

2.4CHX生物碱对大鼠I/R损伤后脑梗死容积的影响

CHX生物碱各给药组的脑梗死容积与单纯I/ R组比较明显下降（P＜0.01）；各给药组间脑梗死的容积比较差异无统计学意义.见表4.

表4　CHX生物碱对鼠缺血-再灌注损伤脑梗死容积影响Tab.4　Effect of CHX A lkaloids on cerebral infarction volume in I/R rats　（n=10，±s）

表4　CHX生物碱对鼠缺血-再灌注损伤脑梗死容积影响Tab.4　Effect of CHX A lkaloids on cerebral infarction volume in I/R rats　（n=10，±s）

注:经q检验两两比较，a，b，c，d为P＜0.01

组别　n　脑梗死容积/mm3I/R/（mL·kg-1）　10　164.1±38.2abcdCHX/（50mg·kg-1）　10　78.6±22.1aCHX/（100mg·kg-1）　10　51.1±18.6bCHX/（200mg·kg-1）　10　54.3±20.6cGGS/（5mg·kg-1）　10　58.5±23.6d

3　讨　论

目前，因缺血引起的心脑疾病发病率出现逐年升高的趋势，并成为威胁人类生命及健康的主要病因之一，此疾病具有很高致死率和致残率，已然成为当代医学界的热点课题之一.脑细胞对缺氧极为敏感，若在短期内少量缺血只引起可逆性的脑细胞损伤，但若长时间较严重地缺血即会引起脑细胞梗死.临床上处理脑缺血性损伤的原则是尽早尽快地恢复脑组织的血流，在某种程度上使脑组织的功能恢复.而近几年的研究［8］发现:脑缺血后再恢复脑血流可致进一步脑组织损伤及其功能障碍，称之为脑缺血-再灌注损伤.脑细胞缺血后已造成脑功能一定程度的损伤，若再灌注可进一步加重脑损伤，而这种再灌注性的损伤机制可能与氧自由基大量产生密切相关.因此，临床上抑制脑缺血后因再灌注引起的损伤已成为当前临床上治疗缺血性脑卒中的关键环节.

近几年的研究发现:脑缺血后血流重新恢复后，若超过再灌注的时间窗（约3 h）时脑细胞线粒体均已被破坏殆尽，因而不能再利用有氧氧化产生ATP，再灌注运输的氧只能产生新的·O2-（在黄嘌呤氧化酶作用下），O2-性质极不稳定，若·O2-在生物体内大量存在，可诱发氧自由基产生的启动环节，可产生多方面的不利因素，不但不断生成新的活性氧，又可使原有的烷自由基转化为氧自由基，产生大量新的氧自由基.同时，再灌注时Ca2+可使细胞内黄嘌呤氧化酶的生物学活性提高，细胞内的Fe3+可促使·O2-快速地转化为·OH，激发细胞内自由基发生连锁反应，造成细胞更多的损伤［9］.

生物体内的自由基可通过下列诸多环节导致生物体的脑细胞组织损伤［10-14］:1）氧自由基过量生成时可引起蛋白质、脂质和核酸的过氧化，使胞膜结构的完整性破坏、蛋白质肽链降解、核酸双螺旋链断裂，致细胞崩解出现不可逆性改变，最终导致神经细胞死亡；2）促使膜脂质中的花生四烯酸转化为血栓烷，诱导血管痉挛、血小板聚集，脑梗死范围扩大，脑组织损伤加重；3）内皮细胞损伤引起血-脑屏障功能减弱及脑组织微循环障碍；4）脑细胞内产生氧自由基过多时，可阻碍脑细胞重摄取兴奋性氨基酸，致脑组织出现神经毒性损伤；5）在脑I/R损伤中，氧自由基的细胞毒性还体现在对细胞线粒体损伤，包括对细胞线粒体DNA（mtDNA）及呼吸链损伤后引发线粒体的膜脂质过氧化.总而言之，氧自由基生成增加会引发脂质的过氧化，引起脑细胞膜结构及DNA的损伤，致脑细胞的水肿、细胞质膜破裂、细胞内酶及炎性介质的大量释放，最终引起细胞坏死.

研究表明:使用CHX生物碱后大鼠血清SOD活力明显提高，MDA含量下降［11-16］，大鼠血液中MDA含量的变化间接地反映了Wistar大鼠脑组织中氧自由基含量的变化，近而也反映了脑组织中脂质过氧化程度及大鼠脑细胞损伤程度.SOD是生物体内清除自由基的主要酶系，SOD活性的高低反映了生物体自身清除氧自由基的能力［12-13］.本实验结果说明CHX生物碱能很好地够稳定脑细胞膜结构，并抵抗脑细胞膜及膜性结构受到氧自由基的攻击，最终达到其清除氧自由基目的，对脑缺氧-再灌注损伤起到了一定的保护作用.

实验结果显示:鼠脑I/R后脑组织中MDA含量与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01），SOD的活性明显下降（P＜0.01），这说明氧自由基引起脑组织脂质过氧化损伤在大鼠脑I/R损伤中非常的显著.与单纯 I/R组比较，CHX生物碱（100，200mg/kg）各组鼠脑组织中的MDA含量降低显著（P＜0.05），而SOD的活性升高显著（P＜0.01）.由此可见，CHX的生物碱能清除因I/R引发鼠脑组织中自由基的增加，从而减轻I/R后鼠脑组织的病理改变.

在研究过程中还发现:CHX生物碱（100，200 mg/kg）组与单纯I/R组比较，大鼠脑组织的含水量、脑梗死容积及面积显著降低（P＜0.01）.致使实验大鼠的脑缺血3 h、再灌注2 h后，均出现不同程度的神经损伤.所有实验鼠脑的神经功能障碍损伤评分显示:CHX生物碱（100，200mg/kg）组、GGS 5mg/kg组与脑I/R组损伤比较差异具有统计学意义（P＜0.05），上述实验结果均证实了CHX提取物（即生物碱）对Wistar大鼠脑I/R的损伤具有保护作用.提示中大剂量的CHX生物碱，尤其中剂量可明显改善I/R大鼠神经功能，减轻脑水肿，增强脑组织对I/R损伤的耐受性，对脑组织有一定的保护作用.

从目前的研究结果看，大鼠脑I/R损伤的机制比较多，并且相互关联及相互影响着，形成似“网状”结构，其发病机制“主线条”尚不明确.因此，对大鼠脑I/R损伤发病的主因探寻是本领域研究的重点.CHX生物碱作为氧自由基的清除剂具有广阔的应用前景［14-17］.

［1］刘永镇，崔顺植，崔炯谟，等.延边地区不同产地东川芎生药学比较研究［J］.延边医学院学报，1994，17（3）:210.

［2］沈映君.中药药理学［M］.上海:上海科学技术出版社，1995:129-130.

［3］Moncayo J，Freitas G R，Bogousslavsky.Do transient ischemic attack shave a neuroprotective effect［J］.Neurology，2000，54（11）:2089-2094.

［4］辛世萌，刘远洪，聂志余.拴线长度、直径以及大鼠体重与线拴法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究［J］.大连医科大学学报，2000，22（2）:105-107.

［5］王引明，刘春风.线拴法制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型若干问题的探讨［J］.SZHU JMed Sci，2006，26 （3）:392-395.

［6］李兵，章翔，蒋小帆，等.改良四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血模型［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2005，4 （2）:110-113.

［7］Iea-longa E，Weinstein P R，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranectomy in rat［J］. Stroke，1989，20（10）:84-91.

［8］Xu Z，Xu R X，Liu B S，et al.Time window characteristics of cultured rat hippocampal rathippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion［J］.Chin JTraumatol，2005，8（3）:179-182.

［9］Aito H，Aalto K T，Raivio K O.Biphasic ATP depletion caused by transient oxidative exposure is associated with apoptotic cell death in ratembryonal cortical neurons［J］. Pediatr Res，2002，52（1）:40-45.

［10］Honde H M，Korge P，Weiss J N.Mitochondria and ischemia/reperfusion injury［J］.Ann NY Acad，2005，1047:248-258.

［11］王立英，曲娴，刘絮，等.川芎生物碱对大鼠血清中SOD活性、NO、NOS、MDA含量的影响［J］.中国老年学杂志，2008，10（28）:1989-1990.

［12］李笑萍，王维亭，喻培先，等.对大鼠弥漫性不完全脑缺血的保护作用［J］.中国药理学通报，2001，17（3）: 345-347.

［13］王立英，苏海燕，王璇，等.荧光分析活性氧在AngⅡ诱导myoFbs增殖中的作用［J］.分析化学，2015，43 （11）:1889-1896.

［14］朴志刚，朴惠善，金光春，等.川芎嗪对缺血心肌的保护及抗氧化作用的研究［J］.中国生植物资源，2000，19（5）:46-47.

［15］王立英，段大航，杨国庆.川芎生物碱对局灶性脑缺血—再灌注大鼠血清中NO，NOS的影响［J］.北华大学学报（自然科学版），2006，7（2）:138-140.

［16］纪云峰，刘慧霞.川芎生物碱对大鼠脑组织中SOD活性、NO、NOS、MDA含量的影响［J］.中国中医药现代远程教育，2011，9（2）:212-213.

［17］高健，曲晓峰，刘洋，等.川芎生物碱对脑缺血-再灌注大鼠SOD、MDA、神经功能及脑梗死容积的影响［J］.中国老年学杂志，2009，29（1）:22-24.

【责任编辑：陈丽华】

Protective Effect of Chuanxiong Alkaloid on Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

Liu Xu，Jiang Xiuwen，Wang Liying，Shen Xupeng
（Basic Medical College of Beihua University，Jilin 132013，China）

Objective To explore the protective effects of Chuanxiong（ CHX） Alkaloids on cerebral ischemiareperfusion（ I /R） injury in rats.Methods A total of 60 wistar rats were purchased and randomly divided into six groups with 10 rats in each grouop，including ischemia-reperfusion （ I /R） group，sham operated group，the treatment groups and the positive control group.The reversible middle cerebral artery ischemia-reperfusion（ I /R） model was made by suture method.Superoxide dismutase（ SOD） activity and malondialdehyde（ MDA） content of the brain tissue were measured with xanthine oxidase method and thiobarbituric acid method.Neurological injury scores were recorded after the animals regained consciousness，the changes of water content in cerebral tissue was detected，and the results were compared with the sham group.Results Compared with the sham group，in the I /R group，the SOD activity decreased and MDA content increased in brain tissue（ P＜0.01） ，the volume and area of brain infarction significantly increased （ P ＜ 0. 01） ，the content of brain water increased and neurological seriously damaged（ P＜0.05） .Compared with I /R group，the SOD activity of CHX Alkaloids treatment groups was significantly higher（ P＜0.01） ，MDA obviously decreased in brain tissue（ P＜0.05） ，water content in brain tissue decreased，the area and volume of infarction significantly reduced （ P ＜ 0. 01） ，and neurologic injury score wasobviously different（ P＜0.01） .Conclusion CHX alkaloids can reduce cerebral I /R-induced brain damage，and thus has protective effect on cerebral tissue to some extent.

Chuanxiong Alkaloids；superoxide dismutase；malondialdehyde；cerebral infarction；ischemia-reperfusion

R285.5

A

1009-4822（2016）03-0339-05

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.012

2015-11-21

吉林省科技发展计划项目（20030908-4）；吉林市科技发展计划项目（201536058）.

刘絮（1971-），女，实验师，主要从事病理学研究，E-mail:294760952@qq.com；通信作者:王立英（1974-），女，博士，副教授，主要从事心血管药理学研究，E-mail:ly741023@126.com.