黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞内质网应激及Calumenin蛋白和缝隙连接蛋白CX43的作用*

宣丽颖， 陶谢鑫， 赵雅君， 戈宏焱， 包丽红， 王大鹏， 赵　明△

(1. 内蒙古民族大学医学院， 2. 内蒙古民族大学附属医院， 通辽 028000)



黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞内质网应激及Calumenin蛋白和缝隙连接蛋白CX43的作用*

宣丽颖1， 陶谢鑫2， 赵雅君2， 戈宏焱2， 包丽红1， 王大鹏2， 赵明2△

(1. 内蒙古民族大学医学院， 2. 内蒙古民族大学附属医院， 通辽 028000)

目的：研究黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞内质网应激、网腔钙结合蛋白(calumenin)及缝隙连接蛋白43(CX43)作用。方法：原代培养的乳鼠心肌细胞分3组：对照组(正常细胞)、柯萨奇病毒感染组(正常细胞)、黄芪总黄酮组(正常细胞+黄芪总黄酮)。柯萨奇病毒感染组感染，黄芪总黄酮组感染同时给予黄芪总黄酮20 mg/L。采用免疫组化方法检测培养乳鼠心肌细胞α-SMA蛋白， Western blot技术检测各组心肌细胞Calumenin蛋白及内质网应激伴侣蛋白GRP78，CX43表达。结果：①与对照组相比，柯萨奇病毒感染组心肌细胞GRP78表达增多(P<0.01)，calumenin蛋白及CX43表达减少(P<0.01)；与柯萨奇病毒感染组比较，黄芪总黄酮组心肌细胞GRP78表达减少(P<0.01)，Calumenin蛋白及CX43表达增多(P<0.01)。结论：CVB3可引发心肌细胞内质网伴侣蛋白GRP78表达增加进而发生内质网应激，并使Calumenin蛋白及CX43表达减少；黄芪总黄酮抑制CVB3感染心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78表达从而减轻内质网应激，同时使Calumenin蛋白及CX43表达增多，该实验结果可能与其抗病毒性心肌炎并发心律失常作用密切相关。

柯萨奇B3病毒；内质网应激；网腔钙结合蛋白；缝隙连接蛋白43；心肌细胞；乳鼠

病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是由病毒(主要由柯萨奇病毒引起，另有腺病毒、肠道病毒、EB病毒、人疱疹病毒、细小病毒B19和巨细胞病毒等)侵犯心脏引起的心肌实质或间质的局限性或弥漫性病变[1]。心律失常是VMC常见临床表现之一，常见心悸、胸闷、心前区疼痛、头晕、乏力等症状，严重者出现晕厥甚至阿-斯综合征，是造成VMC病人猝死的主要原因[2]。

内质网(endoplasmic reticulum，ER)在心肌等肌细胞内称肌浆网，内质网是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的细胞器。内质网稳态失衡时，内质网正确折叠蛋白质功能异常，可能致误折叠蛋白在内质网内异常聚集及内质网应激性蛋白分泌增加，并且识别错误折叠蛋白，通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。网腔钙结合蛋白(calumenin) 是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand 结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白[4]，与Ryanodine(雷诺定)受体(RyR2)通道及Ca2+-ATPase( SERCA2a) 相互作用调节心肌细胞钙释放、钙回摄与储存，共同维持钙循环稳态[5]。文献报道calumenin蛋白缓解心肌细胞ERS并减少ERS介导的心肌细胞凋亡数量[6]。

细胞间隙连接通讯在多种细胞行为的控制以及在维护组织和器官平衡起着重要作用。连接蛋白43(connexin 43,CX43)是心室缝隙连接的主要构成成分，其分布及功能的改变对于缝隙连接的活性有重要影响[7]。然而参与调节缝隙连接调节机制还没有被完全理解。那么，在病毒性心肌炎时心肌细胞calumenin蛋白与内质网应激及CX43表达关系是否存在相互调控目前还不得而知。

黄芪总黄酮(total flavonoids of astragalus,TFA)是从蒙古黄芪中分离的主要活性成分[8]。本课题组在实验中发现TFA可显著降低VMC小鼠心律失常发生率[9]，但作用机制尚未完全明确。本研究拟观察柯萨奇B3病毒(coxsackievirus B3,CVB3)感染乳鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、calumenin蛋白及CX43表达及TFA对CVB3感染乳鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、网腔钙结合蛋白(calumenin)及缝隙连CX43作用。进而明确TFA抗VMC心律失常作用是否通过增加心肌细胞calumenin及CX43表达，抑制心肌细胞内质网应激而实现的。

1　材料与方法

1.1动物药品与仪器

1～3 d Balb/c新生乳鼠购置吉林大学基础医学院动物中心,许可证号：scxk(吉)2011-0004; Calumenin antibody购于Bioss公司, GRP78 antibody，CX43 antibody，购于Boster公司，内参抗体 β-actin购于wanleibio公司。柯萨奇B3病毒，Woodruf亲心肌株由吉林大学农牧学院提供。

1.2柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型制备

1.2.1病毒扩增Hela细胞用含10%小牛血清的DMEM 培养液培养, 在对数生长期接种病毒,每天观察, 当90% 的细胞出现细胞病变效应后, 收集病毒液, 重复3次, 病毒悬液分装于-80℃保存。用Reed-Mnench法测定病毒滴度。

1.2.2乳鼠心肌细胞的分离与培养将乳鼠心脏放入培养皿中，用PBS反复清洗。将清洗后的心脏组织剪碎至1～3 mm3小块。加入0.1%Ⅱ型胶原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化后将其移入15 ml离心管1 500 r/min离心7 min去上清。用PBS重悬沉淀，用吸管反复吹打后1 000 r/min离心5 min，用培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织。PBS清洗细胞两次，1 000 r/min离心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培养基重悬细胞，进行细胞计数后放置到培养板中。成纤维细胞贴壁较快，2 h差速贴壁法可去除大量的成纤维细胞，上清悬液中为较纯的心肌细胞。细胞放置在培养板后24 h不动，随后每2天换一次液。培养细胞至密度为90%左右，PBS清洗2次。按实验内容将细胞接种于6孔板中，细胞浓度为5×104cells/ml，置于37℃，5% CO2的培养箱内培养过夜。24 h后可进行转染，细胞密度一般在70%为宜。

1.2.3免疫组织化学方法鉴定乳鼠培养心肌细胞为明确培养细胞为心肌细胞，对各组乳鼠培养心肌细胞进行免疫组化鉴定，经下列实验步骤(1)0.1%TritonX-100孵育；(2) 3%过氧化氢孵育；(3) 血清封闭；(4) 一抗孵育；(5)二抗孵育；(6)辣根酶标记；(7) DAB显色；(8) 苏木素复染；(9)镜检。

1.2.4柯萨奇B3病毒感染心肌细胞乳鼠心肌细胞按照细胞浓度为5×104cells/ml接种于6孔板，并将其置于37℃，5% CO2的培养箱内培养过夜，次日柯萨奇B3病毒感染组按每个心肌细胞感染100 PFU的CVB3病毒，黄芪总黄酮组按每个心肌细胞感染100 PFU的CVB3病毒，培养液加黄芪总黄酮20 mg/L，然后在37℃静置于CO2培养箱中3 d。

1.3Western blot检 测各组心肌细胞Calumenin蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及CX43表达：

各组乳鼠心肌细胞经下列实验步骤：(1)蛋白质抽提；(2)采用BCA法进行蛋白质定量；(3)取15 μl的样品进行SDS-PAGE；(4)转印至PVDF膜；(5)封闭；(6)孵育一抗；(7)孵育二抗；(8)ECL底物发光；(9)图像保存。普通抗体的封闭液、一抗孵育液、二抗孵育液为5%脱脂奶粉溶液。检测各组心肌细胞calumenin蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及CX43表达。

1.4统计学方法

2　结果

2.1各组乳鼠培养心肌细胞免疫组化

各组乳鼠培养心肌细胞经免疫组化实验，检测出心肌细胞特有的ɑ-SMA蛋白，确定为心室肌细胞(图1)。

Fig. 1Immunocytochemistry of culturing myocardial cell observed under microscope(×40)

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group

2.2各组心肌细胞Calumenin蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及CX43表达

与对照组相比较，柯萨奇病毒感染组心肌细胞Calumenin蛋白表达显著减少(P<0.01)，内质网应激伴侣蛋白GRP78表达显著增加(P<0.01)，缝隙连接蛋白CX43表达显著减少(P<0.01)；与柯萨奇病毒感染组比较，黄芪总黄酮组心肌细胞Calumenin蛋白表达显著增加(P<0.01)，内质网应激伴侣蛋白GRP78表达显著减少(P<0.01)，缝隙连接蛋白CX43表达显著增加(P<0.01，图2，表1)。

3　讨论

本课题组在前期实验中发现TFA可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位幅值(APA)，延长动作电位时程(APD)[10]；可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞钠电流(ⅠNa)的幅值[11]；可显著增加柯萨奇B3病毒感染心肌细胞内向整流钾电流(IK1) 的幅值[12]；近期研究发现TFA能明显提高VMC小鼠急性期心肌组织CX43 mRNA及蛋白表达[13，14]；黄芪总黄酮延长病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞L-型钙通道关闭时间，减少开放时间抑制钙电流减轻心肌细胞钙超载[15]。上述实验结果说明TFA对VMC并发心律失常具有保护性作用，可减少心律失常发生，并能部分解释TFA减少VMC并发心律失常的作用机制，但TFA对VMC并发心律失常发挥作用的机制尚未完全阐明。

Fig. 2Expression change of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, calumenin and CX43

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group; GRP 78: Glucose-regulated protein 78; CX43: Connecxin 43

Tab. 1Expression change of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, calumenin and CX43

GroupGRP78CalumeninCX43A1628±1392864±2142027±187B1944±175**1433±108**1646±131**C2624±231##1221±106##2369±211##

A：Control group; B: Coxsackievirus B3 infection group; C: Total flavonoids of astragalus group; GRP 78: Glucose-regulated protein 78; CX43: Connecxin 43

**P<0.01vsA group;?##P<0.01vsB group

葡萄糖调节蛋白-78 ( glucose-regulated protein 78,GRP78) , 又称免疫球蛋白重链结合蛋白( binding immunog lobulin heavy chain protein, Bip) 发挥了关键作用。GRP78/Bip 属于HSP70 家族, 可以结合未折叠或错误折叠蛋白质, 促进新生蛋白质的正确折叠, 防止未折叠、错误折叠蛋白质的聚集。在内质网应激条件下, GRP78/Bip 的表达上调非常明显, 因而GRP78/Bip 的诱导表达被广泛用于ERS激活的标志[16]。 我们在前期实验中还观察病毒性心肌炎小鼠心肌细胞发生内质网应激反应[17]，同时黄芪总黄酮可抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞内质网应激反应，对心肌细胞具有保护作用[18,19]，文献报道内质网应激可导致心肌细胞缝隙连接蛋白表达减少及功能失调[20]。本实验观察到CVB3可引发原代培养乳鼠心肌细胞发生内质网应激，以及calumenin蛋白及CX43表达减少；黄芪总黄酮抑制CVB3感染心肌细胞内质网应激，同时使calumenin蛋白及CX43表达增多，根据实验结果我们推断黄芪总黄酮抗病毒性心肌炎并发心律失常作用机制可能与其增加calumenin蛋白及CX43表达，抑制内质网应激伴侣蛋白GRP78表达缓解内质网应激有关。但仍有一些问题尚待明确，比如CVB3引发原代培养乳鼠心肌细胞是先发生内质网应激，继而calumenin蛋白及CX43表达减少；还是先出现calumenin蛋白表达减少，继而发生内质网应激及CX43表达减少。目前尚不清楚，需要在后续实验中先沉默乳鼠心肌细胞calumenin蛋白，再感染CVB3，检测各组心肌细胞内质网应激，calumenin蛋白及CX43表达，从而明确这一发病机制。

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Effect of total flavonoids of astragalus on endoplasmic reticulum chaperone, calumenin and connecxin 43 in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by coxsackievirus B3

XUAN Li-ying1, TAO Xie-xin2, ZHAO Ya-jun2, GE Hong-yan2, BAO Li-hong1, WANG Da-peng2， ZHAO Ming2△

(1. Medical College, The Inner-mongolia National University, 2. Affiliated Hospital of the Inner-mongolia National University, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the effect of total flavonoids of astragalus on the expression of endoplasmic reticulum chaperone, calumenin and connecxin 43 (CX43) in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by coxsackievirus B3(CVB3). Methods: The primary culture of suckling mouse myocardium cells were randomly divided into control group, CVB3 infected group and total flavonoids of astragalus group. Firstly, to confirm the identity of the suckling mouse myocardium, α-SMA was monitored by immunohistochemistry method. Then the protein expression changes of endoplasmic reticulum chaperone-glucose regulatory protein 78(GRP78), calumenin and CX43 were detected by Western blot. Results: ①Compared with that of the control group, the GRP78 expression level in CVB3 infected group was improved, the expression levels of calumenin and CX43 were all reduced. ②Compared with that of CVB3 infected group, GRP78 expression level was decreased, and the expression levels of calumenin and CX43 were increased in total flavonoids of astragalus group. Conclusion: CVB3 infection may cause endoplasmic reticulum stress of rat myocardium cells by increasing the expression of GRP78 and decreasing the expression of calumenin and CX43. On the other hand, total flavonoids of astragalus can reduce the expression of GRP78 and increase the expression of calumenin and CX43.The results of this experiment may be closely related to the effects of anti- arrhythmia with viral myocarditis caused by CVB3.

coxsackievirus B3;endoplasmic reticulum stress;calumenin;connecxin43；myocardium；suckling mouse

国家自然科学基金资助项目(81360587)

2015-05-25

2015-09-28

△Tel: 13474859991； Email: langzhe73@163.com

R331.3

A

1000-6834(2016)01-051-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.013