量子点室温磷光探针检测生物体液中的头孢哌酮钠舒巴坦钠

房晓星, 郑　吉, 闫桂琴

(山西师范大学生命科学学院, 临汾 041000)



量子点室温磷光探针检测生物体液中的头孢哌酮钠舒巴坦钠

房晓星, 郑吉, 闫桂琴

(山西师范大学生命科学学院, 临汾 041000)

以水相合成的3-巯基丙酸包覆的Mn掺杂ZnS量子点(MPA-Mn/ZnS QDs)作为室温磷光探针, 基于头孢哌酮钠舒巴坦钠(CPZ-SBT)作为一种电子受体, 可通过电子转移有效猝灭Mn/ZnS QDs的室温磷光效应, 构建了一种测定痕量CPZ-SBT的方法. 当CPZ-SBT浓度为0.7～84 μg/L时, 其与MPA-Mn/ZnS QDs的磷光强度之间呈良好线性关系, 相关系数为0.99, 该方法的检出限为0.14 μg/L.

量子点; 室温磷光探针; 检测; 头孢哌酮钠舒巴坦钠

近年来, 量子点作为一种介导纳米发光材料, 因具有优异的光电性能和物化性能[1～3]而在生物传感领域被广泛应用[4～9]; 尤其是室温磷光(Room temperature phosphorscence, RTP)量子点, 更为诸多学者所关注. 以Mn掺杂ZnS量子点(Mn/ZnS QDs)为代表的磷光量子点不仅具有磷光寿命长、选择性高及线性范围宽等优点, 而且用于生物体液中小分子检测时能有效避免背景荧光和散色光的干扰[10～12].

头孢哌酮钠舒巴坦钠(CPZ-SBT)作为第三代头孢类复合抗生素, 具有普适的抑菌、抗菌作用, 临床上用于治疗多种感染性疾病[13～15]. 过量服用该药物会出现胃肠道反应、肝损害、静脉炎、凝血功能异常以及双硫仑样等不良反应, 严重者可导致过敏性休克死亡[16]. 因此, 建立一种检测生物体液中CPZ-SBT含量的方法极为必要. 目前, 用于测定CPZ-SBT的方法有高效液相色谱法(HPLC)[17,18]、超高效液相色谱法(UPLC)[19]和荧光法[20]等, 尽管这些方法灵敏有效, 但存在线性范围窄、检出限高、费用高和技术繁琐等不足. 本文基于量子点的优越磷光性能, 以水相合成的3-巯基丙酸包覆的Mn掺杂ZnS量子点(MPA-Mn/ZnS QDs)作为室温磷光探针, 建立了一种方便、快速检测生物体液中痕量CPZ-SBT的方法, 以期为药品的含量标定和快速检测提供新方法.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

Zn(Ac)2·2H2O, Mn(Ac)2·4H2O, Na2S·9H2O, NaH2PO4和Na2HPO4(分析纯, 北京百灵威科技有限公司); 3-巯基丙酸(MPA, Sigma公司); 高纯水(18.2 MΩ·cm, WaterPro系统, Labconco公司); 头孢哌酮钠舒巴坦钠(CPZ-SBT)标准品(G.R.级, 中国药品生物制品检定所); 人血清购于当地医院.

JSM-7500F型透射电子显微镜(TEM, 日本电子株式会社); Cary Eclipse荧光分光光度计和Cary 5000型紫外-可见分光光度计(美国瓦里安公司); pH计(中国雷磁公司); 电子天平(北京赛多利斯公司); DZF-6020型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司); M3-PALSZeta电位仪(英国马尔文公司).

1.2实验方法

1.2.1MPA-Mn/ZnS QDs的合成参照文献[21～23]方法略作改进合成MPA-Mn/ZnS QDs. 在250 mL三口烧瓶中依次加入50 mL 0.04 mol/L MPA, 2 mL 0.01 mol/L Mn(Ac)2和5 mL 0.1 mol/L Zn(Ac)2水溶液, 磁力搅拌均匀, 用1 mol/L NaOH调节溶液pH=11, 通氩气30 min后加入5 mL 0.1 mol/L Na2S, 继续反应20 min; 将溶液在50 ℃水浴中陈化2 h, 冷却至室温后, 用等体积无水乙醇醇沉, 沉淀用乙醇洗涤2～3次, 室温下真空干燥24 h, 即得水溶性良好的MPA-Mn/ZnS QDs粉末.

1.2.2CPZ-SBT的检测在一系列10 mL比色管中, 依次加入500 μL pH=6.0的磷酸缓冲液(PBS)、100 μL 2.0 mg/mL的MPA-Mn/ZnS QDs水溶液及不同浓度的CPZ-SBT溶液, 用高纯水定容至5 mL, 充分摇匀, 静置10 min后进行磷光检测. 检测条件: 激发波长295 nm, 扫描范围500～700 nm, 激发和发射的狭缝宽度分别为10和20 nm.

1.2.3样品分析尿样和血清样均采自健康志愿者, 检测前用高纯水稀释100倍, 无需其它预处理.

2　结果与讨论

2.1量子点结构表征

透射电子显微镜(TEM)和X射线衍射(XRD)表征结果(图1)显示, 所制备的量子点呈球形, 粒径均匀, 直径约为3.5 nm[图1(A)]; 其XRD谱图[图1(B)]具有3个明显的衍射峰, 分别对应立方型闪锌矿结构(111), (220)和(311) 3个晶面的衍射[24];Zeta电位分析[图1(C)]结果表明, Mn/ZnS QDs表面电位为-27.5 mV, 呈负电性, 说明MPA已包覆在Mn/ZnS QDs表面. 此外, 量子点的最大激发和发射波长分别位于295和590 nm处[图1(D)], 这与文献[25,26]报道一致, 即室温磷光(RTP)是由掺杂在ZnS量子点中的Mn2+从三重态(4T1)到基态(6A1)跃迁产生的, ZnS作为一种宽禁带的半导体材料, 其母体能够为Mn2+提供较宽的能级范围, 受激发后ZnS母体的空穴被Mn2+俘获, Mn2+离子上电子空穴对复合并以橙红色磷光形式释放能量.

Fig.1　　　　TEM image(A), XRD pattern(B), zeta potential diagram(C) and the excitation spectrum(a) with phosphorescence emission spectrum(b) of MPA-Mn/ZnS QDs(D) QDs: 40 mg/L; PBS buffer: 20 mmol/L; pH=6.0.

2.2实验条件优化

为了实现对CPZ-SBT溶液的灵敏检测, 考察了pH值、反应时间及NaCl浓度对检测体系的影响. 结果表明, pH值不仅影响量子点的发光强度, 还影响量子点和CPZ-SBT之间的相互作用. 当pH=5.7～7.4时, QDs-CPZ-SBT体系的RTP强度呈增加趋势; pH=7.4～10.0时, RTP强度呈下降趋势[图2(A)]. 据文献[27]报道, CPZ-SBT在pH=3.5～6.5范围内最稳定, 在碱性条件下其结构易受到破坏而影响其与QDs的作用, 同时伴随CPZ-SBT对QDs猝灭程度的减弱. 由图2可见, pH=6.0～7.0时, QDs及QDs-CPZ-SBT体系的RTP强度相对稳定, 且当pH=6.0时, CPZ-SBT对QDs的RTP猝灭程度最大, 因此选择pH=6.0为实验最佳pH值. 反应时间和NaCl浓度对体系的影响结果显示, 在量子点溶液中加入CPZ-SBT后, 10 min后不再发生明显变化且30 min内保持稳定[图2(B)], 为便于测定, 选择反应进行10 min 后测定; 而NaCl浓度在0～0.03 mol/L范围内对体系的RTP强度无明显影响[图2(C)].

Fig.2　　　　Effects of pH(A), time(B) and NaCl concentration(C) on the RTP intensity of QDs and QDs-CPZ-SBTQDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L.

2.3CPZ-SBT的检测

在最佳反应条件下, 随着CPZ-SBT浓度的增大, MPA-Mn/ZnS QDs的RTP强度在590 nm处呈规律性猝灭[图3(A)], 当CPZ-SBT浓度达到84 μg/L后, 随着CPZ-SBT浓度的增大, RTP强度不再发生明显变化, 且其强度降为原来的1/3[图3(A)插图].

Fig.3　　　　CPZ-SBT concentration-dependent RTP emission of the QDs(A) and the variation of ΔP(P0-P) as a function of CPZ-SBTQDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L; PBS: 20 mmol/L, pH=6.0.

在0.7～84 μg/L范围内, MPA-Mn/ZnS QDs的RTP猝灭值(ΔP)与CPZ-SBT浓度呈良好线性关系[图3(B)]. 标准曲线方程为ΔP=P0-P=2.8673x-1, 相关系数R=0.99, 检出限(3σ)为0.14 μg/L. 与文献[17～20]报道方法相比(表1), 该方法具有更低的检出限和较宽的线性范围, 该体系设计简单、操作方便且干扰较小, 因而实用性更强.

Table 1　Different analytical techniques reported for detection of CPZ-SBT

2.4CPZ-SBT与量子点的作用机制

光致发光猝灭过程可分为动态猝灭和静态猝灭[28]: 动态猝灭指猝灭剂和处于激发态的发光物分子发生相互作用, 又称作碰撞猝灭, 通过电子转移或能量转移实现发光猝灭; 静态猝灭指发光物分子在处于基态时与猝灭剂络合, 形成的络合物不发光, 导致发光猝灭. 可通过Stern-Volmer方程验证动态猝灭和静态猝灭[29]:

式中:P0和P分别为加入猝灭剂前后发光物的光强度;Cq为猝灭剂浓度;KSV为猝灭常数. 根据动态猝灭和静态猝灭的原理, 升高温度时结合常数减小为静态猝灭, 反之为动态猝灭, 因此可通过结合常数的变化判断猝灭方式. 本文运用 Stern-Volmer方程拟合了不同温度下 CPZ-SBT 对MPA-Mn/ZnS QDs磷光的猝灭数据, 结果[图4(A)]显示, 曲线斜率随着温度的升高而增大, 即KSV随着温度的升高而增大, 这是由于随着温度升高, CPZ-SBT 与 MPA-Mn/ZnS QDs 的扩散速率增大, 引起碰撞速率增大, 从而使KSV增大. 据此推测反应体系的猝灭方式可能为动态猝灭[30].

Fig.4　　　　Temperature-dependent response of P0/P to CPZ-SBT(A) and UV-Vis spectra of CPZ-SBT with emission spectra of QDs(B) QDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L. (B) a. CPZ-SBT; b. QDs.

共振能量转移和电子转移是动态猝灭的2种信号传导方式, 而共振能量转移的必要条件之一是供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠. 通过对CPZ-SBT的紫外-可见吸收光谱和MPA-Mn/ZnS QDs的激发光谱[图4(B)]分析显示, 二者无重叠现象, 可排除CPZ-SBT与量子点之间发生共振能量转移的可能性, 因此判断其猝灭方式更可能由电子转移所致.

Fig.5　　　　Fluorescence(A), UV-Vis absorption(B), RLS of QDs-CPZ-SBT(C) spectra and changes of QDs-CPZ-SBT RLS after addition of NaCl(D)(QDs, 40 mg/L; CPZ-SBT, 84 μg/L)(A) a. CPZ-SBT; b. QDs; c. QDs-CPZ-SBT(QDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L); (B) a. CPZ-SBT; b. QDs; c. QDs-CPZ-SBT(QDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 42 μg/L); d. QDs-CPZ-SBT(QDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L); (C) QDs: 40 mg/L; concentration of CPZ-SBT/(μg·L-1): 0, 14, 28, 42, 56, 84; (D) QDs: 40 mg/L; CPZ-SBT: 84 μg/L; NaCl: 0.04, 0.10, 0.20, 0.30 mol/L.

荧光光谱[图5(A)]显示, CPZ-SBT和量子点在590 nm处均有一定强度的荧光(谱线a和b), 但是当CPZ-SBT与量子点混合后, 体系荧光在590 nm处强度明显增强(谱线c), 且并非二者数据简单叠加所致, 表明CPZ-SBT和MPA-Mn/ZnS QDs之间发生了相互作用.

分析了CPZ-SBT(谱线a)和QDs-CPZ-SBT(谱线c和d)的紫外光谱. 向量子点溶液(谱线b)中加入CPZ-SBT后, 体系的紫外光谱逐渐增强并发生红移 [见图5(B)], 表明量子点和CPZ-SBT之间相互作用致使量子点表面态改变而影响其紫外吸收.

如果2种物质通过静电作用形成更大的散射粒子, 则会产生更强的共振光散射信号. 通过对QDs-CPZ-SBT体系的共振光散射RLS光谱[图5(C)]分析显示, 在波长200～700 nm范围内, 随着量子点溶液中CPZ-SBT浓度的增大, QDs-CPZ-SBT体系的RLS逐渐增强, 表明CPZ-SBT与量子点形成了更大的散射粒子, 可能原因是量子点表面存在大量羧基, 呈电负性. CPZ-SBT作为一种强碱弱酸盐, 呈正电性, 二者在pH=6.0的PBS缓冲液中呈相反电性[14,31], 极易通过静电吸引而结合.

通过探究NaCl对QDs/CPZ-SBT体系RLS强度的影响进一步证实了以上推断, 由图5(D)可见, NaCl浓度在0.04～0.3 mol/L之间变化时, 体系RLS强度逐渐减弱. 另外, 由于CPZ-SBT分子中存在多个不饱和的氮原子和羰基, 因此 CPZ-SBT可作为电子受体接受量子点激发态电子, 从而阻碍Mn2+上电子空穴对的复合, 使其磷光猝灭. 综上所述, 量子点和CPZ-SBT之间通过静电作用发生电子转移使体系RTP减弱, 可能作用模式如Scheme 1所示.

Scheme 1　Mechanism of the RTP quenching process

2.5干扰实验

为了考察所建立方法的选择性, 考察了生物体液中可能存在的无机离子和生物分子对检测的影响. 结果表明, 在CPZ-SBT浓度为5 μg/L时, 200倍的Na+, K+和甘氨酸(L-Gly), 150倍的Ca2+和半胱氨酸(L-Cys), 100倍的Mg2+和葡萄糖以及300倍的丝氨酸(Serine)对检测结果无明显影响(见表2), 说明建立的方法具有较好的选择性.

Table 2　Tolerance of foreign substances

2.6实际样品分析

为了考察方法实际应用的可行性, 进行了尿液和血清加标回收实验. 在最优实验条件下, 分别将尿样和血清稀释100倍进行加标回收实验, 结果(表3)显示, CPZ-SBT的回收率为95.3%～103.7%, 相对标准偏差为1.09%～2.89%. 此结果表明, MPA-Mn/ZnS QDs RTP探针适合人体液中CPZ-SBT的检测.

Table 3　Detection of CPZ-SBT in real samples(n=3)

Fig.6　　　　Phosphorescence and fluorescence spectra of urine(a, d) and serum(b, c)

实际样品分析结果(图6)显示, 人尿液和血清无背景磷光(谱线a和b), 却有较强的背景荧光(谱线c和d). 这是由于生物体液中许多蛋白质和其它生物分子都具有自体荧光, 却不存在自发磷光现象, 表明该方法适用于生物体液中CPZ-SBT的检测.

综上所述, 以3-巯基丙酸包覆的Mn掺杂ZnS量子点为室温磷光探针, 构建了一种测定痕量头孢哌酮钠舒巴坦钠的方法, 并实现了生物体液中痕量头孢哌酮钠舒巴坦钠的检测. 该方法的线性范围为0.7～84 μg/L, 检出限为0.14 μg/L, 加标回收率为 95.3%～103.7%. 该检测体系设计简单、操作方便, 且不受体液背景荧光和散射光的干扰, 期望可为药物含量标定及临床检测提供一种分析方法.

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(Ed.: N, K)

† Supported by the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(No.20111404110002) and the Construction Program of Chemical Advantage and Key Discipline of Shanxi Province of China(No.912019).

Detection of Cefoperazone Sodium and Sulbactam Sodium in Biological Fluid by Quantum Dots Room Temperature Phosphorescence Probe†

FANG Xiaoxing, ZHENG Ji, YAN Guiqin*

(SchoolofLifeScience,ShanxiNormalUniversity,Linfen041000,China)

A method for the determination of trace cefoperazone sodium-sulbactam sodium(CPZ-SBT) was established using water phase synthesized 3-mercaptopropionic acid-capped Mn-doped ZnS quantum dots(MPA-Mn/ZnS QDs) as a room temperature phosphorescence(RTP) probe, which based on the phenomenon that the electron acceptor acted by CPZ-SBT can effectively quench the RTP of MPA-Mn/ZnS QDs through electron transfer. There is a good relationship between CPZ-SBT and changes on the phosphorescence intensity of MPA-Mn/ZnS QDs when the concentration of CPZ-SBT is in the scope of 0.7—84 μg/L. The correlation coefficient and detection limit of this method are 0.99 and 0.14 μg/L, respectively. Additionally, this method is able to conduct analysis simply without deoxidizer, inducer or complex sample processing, which can effectively avoid the interference of background fluorescence and scattered light in biological fluids and can be successfully applied in trace determination of CPZ-SBT in biological fluids as well.

Quantum dots; Room temperature phosphorescence probe; Detection; Cefoperazone sodium-sulbactam sodium(CPZ-SBT)

2016-01-30. 网络出版日期: 2016-07-11.

国家教育部博士点联合基金(批准号: 20111404110002)和山西省重点化学优势学科建设项目(批准号: 912019)资助.

O657.3

A

联系人简介: 闫桂琴, 女, 博士, 教授, 主要从事生物分析化学方面的研究. E-mail: gqyan2013@163.com