UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中防止假阳性的应用

郭建华，李向碧，岳秀阳，曹　政

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460；2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 荣昌 402460）

UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中防止假阳性的应用

郭建华1，李向碧2，岳秀阳2，曹政2

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460；2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 荣昌 402460）

为了研究尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）在减少兽用生物制品支原体PCR检测中的假阳性情况，本研究通过在PCR试剂中加入UNG酶，在PCR反应前25℃作用10 min，再50℃作用2 min，结果显示，该法可以有效防止PCR产物的污染，减少假阳性的产生。

UNG酶；兽用生物制品；PCR；假阳性

支原体是无细胞壁、必须细胞内寄生的单细胞微生物，经常见于生物制品的污染[1]。现行的中国兽药典中，对支原体的检查规定用细胞培养法，在显微镜下看到支原体菌落作为判断的依据，但检查的时间长达29 d，所以常见于成品、血清的检验，对半成品、原辅材料则用培养法检验不能满足需要，所以很多厂家采用更加快捷的PCR方法进行检验。

PCR方法非常敏感，但在阴性对照甚至空白对照中会出现假阳性的情况，使实验者无法对结果进行判断。尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）可以降解含有脱氧尿嘧啶核苷酸（dU）的双链DNA或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键。如果在PCR反应体系中以dUTP取代dTTP，使PCR产物都是含有dU的DNA链，在PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。因此UNG酶广泛用于医学检验中，但在兽用生物制品中，还未见报道[2-3]。

本研究以猪瘟细胞苗产品、生产用牛睾丸细胞作为检验对象，研究了UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中消除假阳性的作用。

1　材料与方法

1.1材料细胞源猪瘟活疫苗，重庆澳龙生物制品有限公司2014年生产，血清是内蒙古金源康生物工程有限公司生产。

UNG酶、dUTP、Taq DNA聚合酶（5 units/μL）（附10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3）、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP均为10 mmol/L）、DNA分子量标准DL-2 000、支原体核酸提取试剂盒等，购自上宝生物工程（大连）有限公司。

猪鼻支原体，购自中国兽医药品监察所。

1.2方法

1.2.1引物的来源与合成扩增用引物序列来自参考文献[4-5]，正向引物序列为：5′-ACACCAT⁃GGGAGCTGGTAAT-3′，反向引物序列为：5′-CTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′，引物由Invitrogen（上海）合成。

1.2.2样品的处理与DNA提取样品的处理按照2010版《中国兽药典》第3部进行[6]：随机取5瓶疫苗制品，分别用生理盐水将冻干品复原到10头份每mL，将5瓶稀释液充分混匀制成混悬液，用来提取DNA。

1.2.3PCR反应取1 μL制备的基因组DNA为模板（约50 ng），加入下面的PCR反应体系中：50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris（pH值8.3），1.5 mmol/ L MgCl2，0.001%（wt/vol）gelatin，引物各为 0.6 μmol/L，dNTP各为200 μmol/L，Taq DNA酶1.5 U，UNG酶1U、dUTP600 μmol/L，共20 μL。反应条件：25℃UNG酶处理2 min，95℃2 min使UNG酶失活，95℃预变性，5 min；95℃变性，1 min，57℃退火温度下退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后在72℃下10 min延伸。扩增完后，保存-20℃保存备用。阳性对照组加猪鼻支原体DNA为模板，阴性对照组不加模板，以生理盐水替代，不加UNG酶的试验组反应体系中不加入UNG酶和dUTP，25℃10 min和95℃2 min反应步骤，其余不变。

1.2.4电泳检测取PCR产物5 μL，在1.0%（w/ v）琼脂糖凝胶进行电泳，电场强度5 V/cm，时间50 min。

2　结果

2.1不加UNG酶的试验组PCR结果如图1所示，阴性对照、血清样品、猪瘟疫苗均出现与阳性对照相同的条带（300 bp）。

图1　不加UNG酶组PCR产物电泳图

2.2UNG酶添加组电泳结果如图2所示，阴性对照、血清样品、猪瘟疫苗均无特异条带。

图2　UNG酶添加组PCR产物电泳图

3　讨论

本试验中，在不加入UNG酶时，阳性对照、样品、阴性对照都有特异性条带，甚至有时候换掉所有的试剂，仍然会出现同样的结果。加了UNG酶后，样品、阴性对照的特异性条带消失了。为了验证PCR结果的可靠性，在本研究中，所有检验样本血清、猪瘟疫苗成品、阳性对照均按照中国兽药典的方法进行了培养法检验，结果与加了UNG酶的结果一致。2014年本公司猪瘟疫苗成品中也未检出支原体，对各批次成品、半成品的PCR检验结果表明，加UNG酶后也不影响检验的敏感性与特异性。

本研究的UNG酶可消除PCR产物污染。其造成PCR假阳性原因还有很多，要彻底根除PCR的假阳性。还需要严格操作和区分操作，如DNA提取区域、加PCR试剂区域、加模板区域、电泳区域，用的微量移液器也不能混用，另外套式PCR、Touchdown PCR等方法也能提高试验的特异性和重复性[7]，企业可以采用多种技术，指定操作规程，保证检验的可靠性。

当然，对生物制品的成品是否被支原体污染的检验以及下最终的结论，还需要按照中国兽药典的培养法来进行。需要指出的是，对于被检样品被灭活的支原体，PCR仍然可以检测出来，培养法却检测不出来。笔者建议用多种方法互相验证，确保产品的质量，PCR检验更用于牛睾丸、生产用细胞原辅材料以及中间品的快速检验，培养法更多用于成品的检验。

[1]Zhi Y，Mayhew A，Seng N，et al.Validation of a PCR method for the detection of mycoplasmas according to European Pharmaco⁃poeia section 2.6.7[J].Biologicals，2010，38：232-237.

[2]郭兆彪，张敏丽，汪晓辉，等.用尿嘧啶糖基化酶预防PCR污染的研究[J].中国兽医科技，1999，29（3）：12-14.

[3]王省良，周东耀，王丽之，等.尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对DNA杂交的影响[J].第一军医大学学报，2000，20（4）：319-321.

[4]Jung H，Wang S Y，Yang I W，et al.Detection and treatment of Mycoplasma contamination in cultured cell[J].Chang Gung Med J，2003，26（4）：250-258.

[5]Janardhan K S，Hays M，Dyer N，et al.Mycoplasma bovis out⁃break in a herd of North American biston（Biston biston）[J].J Vet Diagn Invest，2010，22：797-801.

[6]中国兽药典委员会.中国兽药典（3部）[M].北京：中国农业出版社，2010：附录49.

[7]Joyce W M，熊祺琰，韦艳娜，等.套式PCR检测中国江苏省猪场猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染[J].中国人兽共患病学报，2014，30（8）：800-805.

Application of Uracil-N-glycosylaseto Avoid FalsePositivein theDetection of Mycoplasma Contaminatein Veterinary Biological Products

GUO Jian-hua1，LI Xiang-bi2，YUE Xiu-yang2，CAO Zheng2
（1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China）

To investigate the method of avoidance of false positive in the detection of mycoplasma contaminate in veterinary bi⁃ological productions，Uracil-N-glycosylase was added to PCR reaction mix.And 25℃for 10 minutes and 50℃for 2 minutes were processed before PCR reaction.The results showed that uracil-N-glycosylase prevented the contamination of PCR products and re⁃duced the false positive efficiently.Uracil-N-glycosylase can avoid false positive in detection of mycoplasma contamination in vet⁃erinary biological production.

Uracil-N-glycosylase；Biological products；PCR；False positive

CAO Zheng

TQ464.8

A

0529-6005（2016）07-0083-02

2015-03-25

西南大学科研基金资助（08BSr04）

郭建华（1977-），男，副教授，博士，从事微生物资源开发与分子生物学研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com