miRNA-15a在前列腺癌中的表达及诊断意义

姚春红　袁新初　刘　冲　邓建平

(武汉科技大学医学院， 武汉430081)



miRNA-15a在前列腺癌中的表达及诊断意义

姚春红袁新初刘冲①邓建平①

(武汉科技大学医学院， 武汉430081)

①湖北省黄石市爱康医院，黄石435000。

目的：检测前列腺癌患者miRNA-15a的表达情况，探讨其在前列腺癌诊断的意义。方法：选择2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者血清及肿瘤组织36例，良性前列腺增生患者(Prostatic hyperplasia，BPH)血清40例，健康对照血清40例。miRNA-15a表达采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测。结果：miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康对照血清的表达量分别为(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)，miRNA-15a在前列腺癌患者血清中的表达量显著低于良性前列腺增生患者和健康对照(P<0.05)，在BPH组和对照组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，前列腺癌患者血清miRNA-15a表达在不同PSA表达水平、Gleason评分、临床分期、有无远处转移之间差异有统计学意义(P<0.05)，与其他病理因素无关(P>0.05)；前列腺癌患者肿瘤组织中的miRNA-15a的表达与PSA表达水平、Gleason评分、临床分期、有无远处转移之间差异有统计学意义(P<0.05)，与其他病理因素无关(P>0.05)。结论：miRNA-15a低表达参与了前列腺癌的发生、发展过程，是前列腺癌辅助诊断及治疗的潜在的指标。

前列腺癌；良性前列腺增生；miRNA-15a

前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤，是男性因癌症死亡的第二大原因，发病率随年龄增长而升高[1,2]。前列腺癌早期通常没有症状，只有当肿瘤阻塞尿道、膀胱颈时，发生类似下尿道梗阻或刺激症状，才引起注意。因此早期诊断和早期治疗是决定肿瘤患者治愈率及预后的一个重要因素，寻找可靠、有效的分子标记物来指导前列腺癌的诊断和预后分析仍然是临床上研究的热点[3]。微小RNA(miRNA)是一种大小为22 nt左右的非编码单链小分子。其通过与靶基因互补配对，在翻译水平调控基因的表达，在细胞的增殖和凋亡、器官形成、发育等生命过程中发挥着重要的作用[4]。miRNA-15a定位于人类染色体13q14.2，属于miRNA-15家族，研究表明miR-15a在肿瘤中表达缺失或下调。本研究检测了前列腺癌患者miRNA-15a表达的情况，探讨其与前列腺癌的关系，研究其对前列腺癌诊断的价值，并分析miRNA-15a的表达水平与PCa临床病理参数的关系。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象选择2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者36例，年龄49～73岁，平均(63.44±6.41)岁，其中患者年龄≥60岁24例，<60岁12例；肿瘤按TMM(2012AJCC)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；病理按Gleason评分分级：高分化腺癌(Gleason 2～6分)24例，中分化腺癌(Gleason 7分)7例，低分化腺癌(Gleason 8～10分)5例。BPH患者30例，平均年龄(61.6±8.1)岁，对照者为40例健康体检男性血清，年龄22～55岁，平均(35.7±18.34)岁。所有标本-80℃保存。所有疾病术前未做任何治疗、放疗和化疗。

1.1.2主要试剂和仪器Trizol、RNA提取试剂盒、M- MLV逆转录酶、荧光定量PCR(Real-time PCR)检测试剂盒购自大连宝生物科技公司，Has-miRNA-15a茎环引物由上海吉玛生物科技有限公司设计合成，Real-time PCR仪为美国罗氏公司产品。

1.2方法

1.2.1标本收集与处理采集患者静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，吸取上清于2 ml离心管中，再次12 000 r/min离心2 min，吸取上层无细胞血清200 μl，置于-80℃ 低温冰箱内保存待测。采用Trizol试剂从血清样本中提取总RNA，紫外分光光度计测RNA浓度及纯度，取吸光度比值为1.8～2.1的样品用于后续试验。蜡块组织标本RNA抽提按照 Trizol 说明书进行。取200 ng总RNA，M- MLV逆转录酶进行逆转录，反应体系为20 μl，包括10×缓冲液2 μl，M-MLV(10 U/μl)0.4 μl，引物(400 nmol/L)0.5 μl，RNA 酶抑制剂(40 U/μl)0.6 μl，dNTP混合物(2.5 mol/L)2 μl，补超纯水至20 μl。 反应条件为 16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min灭活逆转录酶，产物置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2SYBRGreen法检测miRNA-15a表达水平加入1 mlTrizol，按照试剂盒说明提取细胞RNA，逆转录茎环引物和M- MLV逆转录酶反转录，TaqDNA聚合酶、Has-miRNA-15a茎环引物和SYBRGreen荧光染料定量检测miRNA-15a的表达量。Has-miRNA-15a茎环引物序列为：上游序列5′-GCTGTGGAGAGAAAGGCAGTCTG-3′；下游序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。其中以U6作为内参引物，其上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相对表达量计算公式为RQ=2-△△CT。

2　结果

2.1前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常对照的血清miR-15a表达水平 miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康对照血清的表达量分别为(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表达量显著低于良性前列腺增生患者和健康对照的血清miR-15a表达水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康对照的血清miR-15a表达水平无显著性差异(P>0.05)。如图1。

2.2前列腺癌患者血清miRNA-15a表达变化与PCa 临床病理参数的相关性将前列腺癌患者年龄、PSA表达水平、Gleason评分、临床分期、有无远处转移进行分组，结果显示积分≥7分组与<7分组miRNA-15a的表达量分别为(0.256±0.06)和(0.162±0.071)，差异有统计学意义(P<0.05)。血清miRNA-15a表达水平与临床分期相关(P<0.05)，随着临床分期的增加，miRNA-15a的表达水平降低。骨转移的前列腺癌miRNA-15a表达量与未转移者相比，差异有统计学意义(P<0.05)。但miRNA-15a表达量与PSA水平无关(均P>0.05)，见表1。

2.3前列腺癌患者肿瘤组织中miRNA-15a表达变化与PCa 临床病理参数的相关性将前列腺癌患者年龄、肿瘤大小、PSA表达水平、Gleason评分、临床分期、有无远处转移等进行分组，结果显示肿瘤患者PSA 表达量<10与≥10的患者肿瘤组织中的表达量分别为(0.440±0.178)和(0.304±0.185)，差异有统计学意义(P<0.05)；积分≥7分组与<7分组miRNA-15a的患者肿瘤组织中的表达量分别为(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差异有统计学意义(P<0.05)。血清miRNA-15a表达水平与临床分期相关(P<0.05)，随着临床分期的增加，miRNA-15a的表达水平降低。骨转移的前列腺癌miRNA-15a表达量与未转移者相比，差异有统计学意义(P<0.05)。但miRNA-15a表达量与其他病理参数无关(均P>0.05)，见表2。

图1　前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常对照的血清miR-15a表达水平Fig.1　Benign prostatic hyperplasia,prostate cancer patients and normal controls expression level of serum miR-15aNote: MiRNA-15a amount of expression in prostate cancer patients was significantly lower than patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls(P<0.05),patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls there was no significant difference(P>0.05).

表1　前列腺癌患者血清miRNA-15a表达水平与临床参数的相关性Tab.1　Correlation between expression of serum miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

表2　前列腺癌患者肿块miRNA-15a表达水平与临床参数的相关性Tab.2　Correlation between expression of tumor miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

3　讨论

前列腺癌发病机制尚不明确[5,6]，前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺癌筛选、诊断及预后判断的常用血清学指标，虽然PSA诊断PCa的标准临界值为4.0 ng/ml，但其阳性预测率仅为41.5%[7]，因此PSA的临床运用存在一定的局限性，如良性前列腺增生及前列腺炎等均会出现不同程度的PSA升高，以致影响临床医生的诊断。研究表明miRNA参与前列腺癌的发生、发展密切相关[8-10]，miRNA控制着机体60%以上的基因调控网络。miRNA-15a在多种人类癌症细胞中过表达，具有负调控作用[11]，能够在转录后水平抑制BCL2、CCDI和WNTBA的表达，从而干扰癌基因的多种活动，起到抑制肿瘤发生、发展的作用。最近研究发现，VEGF等也参与miRNA-15a在前列腺癌发生、发展中的抑制作用，这种抑制作用是不依赖于转录作用的，通过多途径对前列腺癌的发展起抑制作用[12]。本研究采用茎环逆转录-荧光定量的方法检测了36例前列腺癌组织中miRNA-15a的表达，与良性前列腺增生患者和健康对照比较，发现miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康对照血清的表达量分别为(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表达量显著低于良性前列腺增生患者和健康对照的血清miR-15a表达水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康对照的血清miR-15a表达水平无显著性差异(P>0.05)。肿瘤组织miRNA-15a表达水平与临床分期相关(P<0.05)，并且与Gleason积分、临床分期及骨转移有关(P<0.05)，但与是否复发及血清PSA水平无明显相关性(P>0.05)。本研究显示积分≥7分组与<7分组miRNA-15a的患者肿瘤组织中的表达量分别为(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差异有统计学意义(P<0.05)。miRNA-15a表达水平与临床分期相关(P<0.05)，随着临床分期的增加，miRNA-15a的

表达水平降低。miRNA-15a在PCa中明显低表达，因此通过检测miRNA-15a的表达水平能够将PCa患者与健康对照者区分开来，在很大程度上可能会提高临床上对PCa患者的早期诊断率。本研究观察到miRNA-15a表达在高PSA表达水平、Gleason评分、临床分期和有远处转移的前列腺癌患者显著低于低PSA表达水平、Gleason评分、临床分期和无远处转移的前列腺癌患者。Gleason评分代表着肿瘤分化的程度，Gleason评分≥7分多属中高危，Gleason评分≤7分者多系低危，可以推断miRNA-15a低表达可能与前列腺癌的发生、发展及侵袭转移，并可能成为前列腺癌预后评估的监测因子。

综上所述，从前列腺癌的早期诊断来看，需要发现灵敏度和特异度较高的诊断标志物，提高诊断率，以减少前列腺穿刺带来的风险和不便。本研究显示前列腺组织中miR-15a的表达与前列腺癌的组织学分级、临床分期和转移等密切相关，低表达参与了前列腺癌的发生、发展过程，miRNA-15a可作为前列腺癌非侵入性诊断和预后的分子标志。

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[收稿2015-11-13修回2016-03-09]

(编辑许四平)

Expression and diagnostic value of miRNA-15a in prostate cancer

YAO Chun-Hong,YUAN Xin-Chu,LIU Chong,DENG Jian-Ping.Wuhan University of Science and Technology School of medicine Wuhan 430081,China

Objective:To explore the diagnostic value of miRNA-15a in patients with prostate cancer.Methods: From January 2014 to January 2015,Gene expression of MiRNA-15a were examined in 36 serum and tumor tissue samples from prostate cancer,40 benign prostatic hyperplasia(BPH)and 40 health volunteers,which examined by quantitative Real-time reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results: The serum expression of miRNA-15a were (0.193±0.081),(0.359±0.04) and (0.376±0.037) in patients with prostate cancer,benign prostatic hyperplasia and healthy controls respectively.miRNA-15a expression was significantly lower in BPH and healthy controls than patients with prostate cancer(P<0.05).There were no significant difference between BPH and control group(P>0.05).Serum miRNA-15a expression in patients with prostate cancer at different expression levels PSA,Gleason score,clinical stage,the difference between the presence of distant metastasis was statistically significant(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05);Prostate cancer tumor tissue expression and PSA expression levels of miRNA-15a,Gleason score,clinical stage,presence of distant metastasis was statistically significant difference between(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05).Conclusion: Low expression of miRNA-15a may be contributed in the development of prostate cancer,and the expression levels miRNA-15a may be considered potential novel biomarkers for the diagnosis of prostate cancer.

Prostate cancer;Benign prostatic hyperplasia;miRNA-15a

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.030

R737文献标志码A

1000-484X(2016)08-1219-04

姚春红(1972年-)，男，副主任技师，主要从事免疫学检验，E-mail:ych335@163.com。

及指导教师：袁新初(1953年-)，男，教授，主要从事心血管疾病和肿瘤的研究，E-mail:y5307@126.com。