流式细胞术检测红细胞渗透脆性有效性分析

程群英　邹春标

(遂昌县妇幼保健所检验科，丽水323300)



流式细胞术检测红细胞渗透脆性有效性分析

程群英邹春标①

(遂昌县妇幼保健所检验科，丽水323300)

①遂昌县妇幼保健所男性婚检科，丽水323300。

红细胞渗透脆性试验(RBC fragility test)是利用不同浓度的低张氯化钠(Sodium chloride，NaCl)溶液来测定红血球细胞膜渗透压的耐受性。当红血球处于低张溶液中时，水分会移入细胞内，使得红血球膨胀，随着NaCl浓度降低，红血球逐渐胀大破裂而释出血红素，出现溶血(Hemolysis)现象。然而，红血球细胞膜渗透压的耐受性跟细胞表面积与体积比(Surface area to volume ratio，S/V)有关，S/V 比值较大之红血球对低张溶液的耐受性较高，相反地，比值较小者对低张溶液的耐受性较低，容易导致红血球破裂，即红细胞渗透脆性增加[1，2]。

临床上，红细胞渗透脆性试验常应用于遗传性球形红血球增多症(Hereditary spherocytosis)的辅助诊断，由于球状红血球S/V比值较小，在低张溶液中承受水分移入细胞内胀大的能力较正常双凹盘状红血球差，因此红细胞渗透脆性相对增加[3]。对于轻度遗传性球形红血球增多症的病人，若将其血液检体于37℃孵育24 h后进行红细胞渗透脆性试验，可增加其敏感度，但目前实验室常用的孵育型红细胞渗透脆性试验在测试效率和准确性方面差强人意，急需寻找新的测试方法进行红细胞渗透脆性试验。

本文在以上文献研究的基础上，利用流式细胞仪的方法，探测红血球细胞膜上的Band 3，与传统红细胞渗透脆性试验需要2 d的操作时间相比较，使用流式细胞仪的检查在2 h之内即可完成，可以针对遗传性球形红细胞增多症患者做快速的检查。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1对象本研究的对象为本院内科诊断的各类病人，总共33例，其中男性为15例，女性为18例，年龄在12～47岁，各类贫血疾病组，共20例，其中男性8例，女性12例，遗传性球形红细胞增多症(Hereditary Spherocytosis)组，共8例，其中男性4例，女性4例，以及健康正常人组，共5例，男3例，女2例。

1.1.2仪器设备①酸碱指示计：Jenco micrecom-puter pH-VISION 6071;②离心机：Kubota 5400，Kubota KA-1000;③微量离心机：Qualitron DW-41;④混合器：Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600 Mixter;⑤光学显微镜：Olympus BH2;⑥电子天秤：Mettler PJ 300;⑦电磁加热搅拌器：Thermolyne Nuova II stir plate;⑧流式细胞仪：Backman Coulter Epics XL;⑨载玻片：Menzel-Glaser SuperFrost Micrescope Slides;⑩盖玻片。

1.2方法

1.2.1试剂处理①周边血全血(Whole blood)：以 EDTA 作为抗凝剂，采取各种贫血疾病的病人与正常人的周边全血做为实验材料；②全白血球(Total White Blood Cell)：将采集到病人与正常人周边血液，以3 000 r/min转速(Kubota KA-1000)，离心15 min后，取血浆与红血球中间Buffy coat 的白血球细胞。由于会吸取到部分红血球，因此加入2次去离子水(ddH2O)混合作用 10 s，再加入等量的 2 倍 PBS 混合均匀来溶解红血球，以300 r/min离心5 min，去除上清液，重复此步骤数次，直到沉淀物完全去除红血球为止。③单核球(Mononuclear Cell)：将10 ml血液(若不足则以1倍 PBS 补足至 10 ml)，缓慢加在 5 ml 的 HISTOPAQUE-1077 之上，以400 r/min离心30 min后，试管中之液体将分为三层，上二层中间白色雾状环，即为单核球-淋巴球层。吸取所得的白血球以1倍 PBS ，300 r/min离5 min方式洗涤一次，若看到红色颗粒存在，表示有红血球细胞残留，则以加入二次去离子水混合作用 10 s，再加入等量的 2 倍 PBS 混合均匀方式溶解红血球，以 300 r/min离心5 min，去除上清液，重复此步骤2～3次，直到沉淀物完全去除红血球为止。

1.2.2实验方法①网状红血球的计数：取待测周边血全血，滴一滴于5 ml 圆底离心管中，取等量Reticulocyte stain(Sigma)均匀混合，取少量做成血液抹片，快速风干，使用光学显微镜以×100油镜观察计数。网状红血球细胞中会见到蓝色的RNA 残留颗粒。计算1 000颗红血球细胞中，所见得网状红血球的数目，最后换算成百分比。所得的结果以﹪表示；②红血球母细胞的计数：将取得之周边血全血，取适量做成血液抹片，快速风干，以流式细胞染色法染色-染色45 s，再加上两倍体积染色90 s，以自来水轻轻将染剂冲洗干净，置于光学显微镜下，以×100油镜观察。计算方法为：计算100 颗白血球的同时，所见到红血球母细胞的数目，以Cell /100WBC表示；③红血球 Band 3的测定：以EDTA 做为抗凝剂取得病人之周边血全血，300 r/min离心15 min后，取最下层红血球部分，以1 倍PBS 洗涤(离心转速3 000 r/min，5 min)，制成洗涤浓缩红血球(Wash packed RBC)。取5 μl的洗涤浓缩红血球与25 μl 0.5 mg/ml的 EMA混合，置于室温下避光反应1 h。去上清液后，以0.5% BSA-PBS 洗涤3次(以Qualitron DW-41 微量离心机最高转速、离心10 s)，加入500 μl 的1 倍PBS 制成细胞悬浮液。取此细胞悬浮液100 μl，再加入1.4 ml的1倍PBS，以流式细胞仪(Flow Cytometer)测定；④网状红血球 Band 3 的测定：以EDTA 做为抗凝剂取得病人之周边血全血10 μl，与50 μl 0.5 mg/ml 的EMA 混合，至于室温下避光反应1 h。去上清液后，以0.5% BSA-PBS 洗涤3次(以Qualitron DW-41 微量离心机最高转速、离心10 s)。将细胞转置于5 ml 圆底离心管中，利用细胞穿透试剂组进行细胞内RNA 的染色，使用的染剂为0.01%之PY 50 μl，置于室温下避光反应30 min，以1 倍PBS、300 g、5 min，洗涤1次，以适量的1 倍PBS 制成细胞悬浮液，以流式细胞仪(Flow Cytometer)测定；⑤流式细胞仪的设定：流式细胞仪设定探测终止条件为，当所探测到的细胞总数达到10 万颗时即终止；或者当细胞数不足时，流式细胞仪的探测时间达5 min后终止。

1.3统计学分析实验数据的统计分析皆使用t-test作为比较的方法。

2　结果

2.1建立测定网状红血球band 3 含量的方法首先观察流式细胞仪下血球分布情形：首先先看全血检体中，各种血球在流式细胞仪下的分布情形。依流式细胞仪正向激光(FS，forward scatter，测细胞大小)与侧向激光(SS，side scatter，测细胞颗粒性)来看，细胞大致的分布结果如图1所示。

在决定打洞的时间上，分别采用3 min、4 min、5 min做实验，结果显示，在3 min与4 min的部分并无多大的差别，但是如果打洞5 min，在大部分的实验当中，细胞都会破裂，如图2所示。又虽然3 min与4 min的细胞分布情形相似，为避免打洞时间过短而造成打洞不完全的情形，因此在往后实验当中，皆以4 min作为打洞的反应时间。

图1　流式细胞仪FS/SS 血球分布图Fig.1　Flow cytometry FS/SS blood cell distribution map

图2　不同打洞时间对细胞分布的影响Fig.2　Effects of different time on cellular distribution holes

图3　HS 病人Band 3表现情形Fig.3　HS patient Band 3 performance situationsNote: A,B,C,D,E are five different hereditary spherocytosis patients,no blood relationship between each other.N is number of experiments,MFI Band performance was measured on amount of average of three patients with red blood cells.

图4　各种贫血患者Band 3的统计图Fig.4　All kinds of anemia in patients with charts of Band 3Note: All patients anemia Band3 measured values for statistical comparison of the MFI,Clearly see HS patients Band3 measured the MFI value than other anemia disease Low.

表1　红血球Band 3表现量的比较Tab.1　Comparison of amount of erythrocyte Band 3 performance

图2A为全血(Whole Blood)细胞分布图，可以见到大部分的细胞为红血球。图2B为全白血球(Total WBC)分布图，可以明显见到四群细胞，依细胞大小以及颗粒性可大致看出单核球(Monocyte)与淋巴球(Lymphocyte)的分布。图2C则为红血球细胞分布图。

2.2各种病人红血球band 3含量的比较接下来我们用此方法来评估所选病人的红血球band 3的表现情形，图3为遗传性球形红细胞增多症病人红血球Band 3的表现，从图3中可以看到，遗传性球形红细胞增多症病人所测得的结果约在40MFI上下，明显较低于正常人与贫血症患者。将所有检体整理如图4所示，可以明显看出遗传性球形红细胞增多症的患者，其红血球细胞膜上Band 3的表现量与其他种类的贫血疾病相较之下有较低的现象，如表1所示。

表2　网状红血球Band 3表现量Tab.2　Reticulocyte Band 3 Performance Measures

2.3各种贫血病人网状红血球与成熟红血球band 3 含量的比较通过前文建立好的测量网状红血球Band 3的方式，分别针对网状红血球与成熟红血球来测定，将所得结果加以比较整理如表2所示。发现无论是哪一种血液疾病，网状红血球Band 3的荧光表现量皆比成熟红血球来的高。

3　讨论

造成遗传性球形红细胞增多症的原因为结构蛋白的缺失。无论是属于细胞膜表面蛋白的缺失，或者是细胞骨架蛋白的缺失，球形血球的形成，都必须经过一段时间，在体内循环，经由肾脏、脾脏等器官之后，受到环境压力之后再渐渐形成为小型的小球形血球。即使不是细胞膜表面蛋白Band3缺失，也会在此过程中释放出含有Band3的颗粒，因此以EMA方法测得红血球细胞膜表面Band3表现量会比正常人或者其他贫血症来得低。网状红血球是属于初期刚释放至血液循环中的红血球，可视为周边循环血中红血球最原始的状态。所以研究网状红血球细胞膜表面Band 3表现的情形，对于遗传性球形红细胞或者是其他蛋白缺失造成的红细胞病变有相当的帮助。过去的文献中并无特别针对网状红血球提出分析其细胞膜表面Band 3含量的方法[4，5]，因此在本论文中建立的一套利用流式细胞仪的方式，快速探测网状红血球Band 3表现量的方法，有其在研究上使用的价值。然而因为网状红血球从骨髓中释放到周边血液之后，经过1～2 d就会完全成为成熟的红血球，因此此方法的限制是必须从病人体内取得检体后24 h内操作。

在使用流式细胞仪测定遗传性球形红细胞增多症的结果中，遗传性球形红细胞增多症的患者，其红血球细胞膜表面Band 3 表现量明显较其他疾病或正常人低，若能加以分析其灵敏度与准确性，便能利用此方法取代传统的红血球渗透脆性试验。也由于此方法所需要的检体数量极少，故也可以用以做为新生儿遗传性疾病筛检之用。另外在测得Band3 的结果与临床血液检查的结果比较之下，于表2中首先可以见到，再生不良性贫血病人检体的MCV 值平均较正常人为有意义的升高，若将其Band 3 MFI 表现量跟normal 群组比较之下，也是有一定程度的上升。因此高MCV还是会影响到红血球细胞膜上Band 3 的表现量，这与先前发表的报告所述[6，7]，Band 3 的表现与细胞大小无关的论点并不相符。

再以其他贫血患者血液学检查来做比较，自体免疫性溶血症的病人，MCV值较正常人来的高，其Band 3 MFI 表现量似乎也较正常人为高，虽然统计上来说是没有意义，但是整体上是有MCV值越大，MFI值越高的趋势。在乙型海洋性贫血症的患者与后天溶血性贫血患者的结果来看，二者的MCV 值都比正常人来的小，但是其红血球细胞膜上Band 3 表现量并没有降低的现象。这又与先前MCV值与Band 3的量有关的说法矛盾[8]。猜测可能是因为MCV 所测得为平均红血球容积，虽然是细胞大小的指标，但是Band 3 平均散布在红血球细胞膜表面，影响其表现量多寡应是取决于血球细胞膜表面积，而MCV值所测的是平均血球容积，代表的是血球的体积，而虽然体积相同却会因为形状不同而有不同的表面积。所以虽然遗传性球形红细胞增多症患者的MCV值与正常人比较之下并没有差别，但是其Band 3表现量却明显低于一般血球细胞。推测细胞变形成圆形导致表面积下降，因此无法以MCV值来讨论遗传性球形红细胞增多症。但是若单取实验中MCV值较高的病人来做比较，结果又可以明显看出，MCV高的病人(MCV>100 fl)，其Band 3的表现量也相对较高，显示MCV值相对较高的血球，与Band 3的含量上升有着某种关系存在。

在成功建立探测网状红血球细胞膜上Band 3 的方法之后，针对各种血液疾病病人的周边血液做网状红血球Band 3 的分析，结果如表3所示，网状红血球的Band 3表现量，约是成熟红血球的两倍，换算成比值来看，可以发现一个有趣的现象。在Leukemia 病人检体测得的结果，其Ret/RBC Band 3的比值相对较小，而此等疾病是在骨髓造血上发生的问题，因此Band 3的变化可能可以作为骨髓内红血球系细胞形成过程的指标。

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[收稿2015-12-28修回2016-03-18]

(编辑许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.021

R556.6文献标志码A

1000-484X(2016)08-1179-04

程群英(1971年-)，女，主管检验师 ，主要从事临床医学检验方面的研究。