miR-634在肝癌中的表达及对肝癌细胞生物学行为的影响

李　飞　李德新　周广朋

(四川省人民医院城东病区 肝胆胰外科，成都610101)



miR-634在肝癌中的表达及对肝癌细胞生物学行为的影响

李飞李德新周广朋①

(四川省人民医院城东病区 肝胆胰外科，成都610101)

①四川省人民医院城东病区内分泌科，成都610101。

目的：检测microRNA-634(miR-634)在肝癌中的表达水平及其对肝癌细胞常见生物学行为的调控作用。方法：采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、Bel7402、Bel7404、SNU739)、69例肝癌组织及匹配癌旁组织中miR-634的相对定量，分析miR-634表达与肝癌患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、Child-Pugh分级、BCLC分期、门静脉癌栓及肝外转移的关系，同时构建miR-634的真核表达载体并转染肝癌细胞系，采用活细胞计数试剂盒CCK-8、流式细胞仪Annexin V/PI双染法和Transwell侵袭实验检测转染miR-634对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。结果：与正常人肝细胞系L-02相比，肝癌细胞的miR-634水平均降低(P<0.05)，表达量依次为HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721；69例肝癌组织的miR-634水平为(0.253±0.019)，低于匹配癌旁组织(P<0.05)，且与肿瘤直径、分化程度、BCLC分期、门静脉癌栓及肝外转移均有关(P<0.05)。过表达组转染24～96 h后的miR-634水平持续升高，与对照组和空转染组的差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组和空转染组相比，转染组的增殖抑制率、凋亡率均升高，但穿膜细胞数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-634在肝癌组织和细胞中均为低表达，且与临床病理参数有关，上调其水平可抑制肝癌细胞增殖及侵袭并诱导凋亡，对于肝癌防治有重要借鉴价值。

肝癌；miR-634；增殖；侵袭；凋亡

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率高且进展迅速，大多患者确诊时已属晚期，复发转移是肝癌治疗失败的主要原因[1,2]。尽管癌症的主要危险因素已阐明，但恶性肿瘤的发生机制目前仍不明确。微核糖核酸(miRNA)是一类进化上高度保守的内源性RNA，可通过抑制或降解靶基因mRNA，从而达到抑制靶基因的作用，近年来发现miRNA对于癌症的发生发展意义重大[2-5]。目前已证实miR-634为新发现的肿瘤抑制因子，在诱导肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用[6,7]，此外，miR-634具有化疗增敏效果[8]。以上结果提示miR-634可作为恶性肿瘤防治的新靶点，但目前在肝癌中的功能尚不清楚。本研究拟在肝癌组织和细胞中观察miR-634的表达并探讨其与肝癌临床病理参数的关系，同时在肝癌细胞中进一步验证其功能，探讨miR-634在肝癌防治中的价值。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株、试剂及仪器人肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、Bel7402、Bel7404、SNU739)及正常人肝细胞系L-02细胞均购自中科院上海生化细胞所细胞库，脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、Trizol总RNA抽提试剂购自美国Invitrogen公司，Brilliant® SYBR® Green QPCR Master Mix购自美国Stratagene公司，M-MLV反转录酶试剂盒购自PROMEGA公司，过表达miR-634的真核表达载体pCDNA3.1(+)-miR-634由上海生工生物工程技术服务有限公司构建。CO2细胞培养箱购自英国Forma Scientific公司，FACS Calibur型流式细胞仪购自美国BD公司，全自动ABI 7300荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.1.2组织样本收集本院病理科2013年5月至2015年3月存档的石蜡包埋肝癌组织及匹配癌旁组织共69例，其中男性46例，女性23例；年龄范围24～76岁，中位年龄为56.5岁，≤50岁者25例，>50岁者44例；肿瘤直径：≤5 cm者28例，>5 cm者41例；分化程度：低、未分化36例，中、高分化33例；Child-Pugh分级：A级41例，B级28例；BCLC分期：B期30例，C期39例；37例有门静脉癌栓；41例有肝外转移。肝癌组织均由两位病理学医师共同诊断，且取样前未行放化疗。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(RT-qPCR)采用研磨机在液氮条件下磨碎组织，严格按照试剂说明书进行总RNA提取，经分光光度计检测后将OD260/OD280≈1.80～2.00的RNA进行逆转录反应，反应条件为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，qPCR使用rilliant® SYBR®Green QPCR Master Mix在ABI 7300荧光定量PCR仪系统上完成。miR-634引物由Premier Primer 5.0 software设计(以U6 RNA为内参)，miR-634上游引物：5′-CCUUCAAUUUGACCGUCCU -3′， 下游引物：5′-AAUAAAACCAGGUCGAAUAGGU-3′； U6 RNA上游引物：5′- CTCGC-TTCGGCAGCACA -3′ ，下游引物：5′- AACGCTTC-ACGAATTTGCGT -3′ 。反应条件为： 95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。实验重复3次。应用2-△△Ct法测定miR-634基因的相对表达量，结果表示为：△△Ct=(CtmiR-634-CtU6)肿瘤组织-(CtmiR-634-CtU6)癌旁组织。采用qPCR检测肝癌细胞相对于正常人肝细胞系L-02细胞的miR-634表达量，同时筛选miR-634水平最低的肝癌细胞用于后续实验。

1.2.2细胞分组及转染根据RT-qPCR结果将miR-634表达量最低的肝癌细胞分为3组，分别为过表达组，转染真核表达载体pCDNA3.1(+)-miR-634的肝癌细胞；空转染组，转染空质粒pCDNA3.1(+)的肝癌细胞；对照组，不行任何干预措施。分别于转染24、48、72和96 h后采取RT-qPCR检测miR-634水平以验证转染效果。

1.2.3CCK-8法将各组细胞接种于96孔板中，置于37 ℃培养箱中培养，分别于转染24、48、72、96 h时每孔加入10 μl CCK-8溶液，于450 nm波长下测定各孔吸光度(A)。根据公式计算：增殖抑制率(%)=(1-空转染组或过表达组A值/对照组A值)×100%。实验重复3次。

1.2.4流式细胞仪PI/Annexin V双染法按1×105个/ml的密度将3组细胞接种培养液中，分别于转染48、96 h收集各组细胞，依次经冷乙醇固定过夜、RNase A孵育后，加入10 μl Annexin V/FITC和0.3 μg PI染色，避光静置15 min后，使用FACS Calibur流式细胞仪检测凋亡情况，计算细胞凋亡百分率。实验重复3次。

1.2.5Transwell侵袭实验 将包被有Matrigel的Transwell 小室置于24孔培养板中，于小室外按照1∶1比例混合的条件培养液(400 μl)，取100 μl胰酶消化各组细胞(密度为1×109细胞/L)，常规孵育24、48 h后，取膜采用棉签擦掉基质胶和未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定后进行结晶紫染色，100 倍光镜下每个滤膜随机挑取8个视野计数穿膜的细胞。实验重复3次。

2　结果

2.1miR-634在肝癌细胞系及肝癌组织中的相对定量图1A显示，与正常人肝细胞系L-02相比，肝癌细胞的miR-634水平均降低(P<0.05)，且表达量依次为HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721，鉴于SMMC7721的miR-634水平最低，故选此细胞株用于研究miR-634对肝癌细胞生物学行为的调控作用；图1B显示与癌旁组织相比，69例肝癌组织的miR-634水平降低至(0.253±0.019)，低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-634水平与肝癌临床病理参数的关系肝癌组织中，miR-634水平与性别、年龄及Child-Pugh分级均无关，但与肿瘤直径、分化程度、BCLC分期、门静脉癌栓及肝外转移均有关(P<0.05)，其中肿瘤直径>5 cm，分化程度为低、未分化，BCLC分期为C期，有门静脉癌栓及有肝外转移者的miR-634水平较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3过表达miR-634对SMMC7721细胞增殖的影响图2A显示，过表达组转染24～96 h后的miR-634水平持续升高，与对照组和空转染组的差异有统计学意义(P<0.05)；图2B显示，过表达组转染后的增殖能力受抑制，与其余两组相比，转染24～96 h后的增殖抑制率均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4过表达miR-634对SMMC7721细胞凋亡率的影响流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测发现过表达miR-634会诱导SMMC7721细胞凋亡，转染组转染后的凋亡率均低于其余两组，转染24 h的凋亡率分别为对照组和空转染组的2.64和2.42倍，转染48 h的分别为对照组和空转染组的3.54和2.78倍，差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组和空转染组转染24、48 h凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

2.5过表达miR-634对SMMC7721细胞侵袭水平的影响 Transwell侵袭实验检测发现过表达miR-634会抑制SMMC7721细胞侵袭，转染组转染后的穿膜细胞数均低于其余两组，转染24 h的穿膜细胞数分别为对照组和空转染组的0.63和0.64倍，转染48 h的分别为对照组和空转染组的0.57和0.53倍，差异均有无统计学意义(P<0.05)，对照组和空转染组转染24、48 h穿膜细胞数的差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

图1　miR-634在肝癌细胞系及肝癌组织中的相对定量Fig.1　miR-634 in hepatocellular carcinoma cell line and relative quantitative in liver cancer tissueNote: A.Liver cancer cell lines;1.L-02;2.HepG 2;3.SMMC7721;4.Bel 7402;5.Bel 7404;6.SNU739;B.Cancer of liver tissue.

表1　肝癌组织中miR-634水平与临床病理参数的关系Tab.1　miR-634 levels in liver cancer tissue relationship with clinicopathological parameters

图2　转染对SMMC7721细胞miR-634水平及增殖抑制率的影响Fig.2　Transfection miR-634 levels on SMMC7721 cells and effect of proliferation inhibition rateNote: A.mrR-634 relative expression;B.Proliferation inhibition rate.

表2　两组转染后的凋亡率和穿膜细胞数比较Tab.2　Comparied with two groups after transfection of apoptosis rate and number of transmembrane cells

图3　过表达miR-634对SMMC7721细胞凋亡和侵袭水平的影响Fig.3　Over expression of miR-634 of SMMC7721 cellNote: A.Cell opsptosis flow detection figure;B.Cells invade transwell detection figure.

3　讨论

近年来，miRNA与肿瘤的发生发展密切相关，已成为肿瘤防治热点，多项研究提示其可调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移等恶性行为，根据miRNA的作用效果分为癌基因或抑癌基因两大类[9,10]。临床研究发现与正常组织相比，肝癌组织及外周血中的miRNA表达谱变化较大[5]，如Wen等[11]发现在与健康体检者相比，肝癌患者血浆中的miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、miR-92a-3p、 miR-132-3p、miR-185-5p、miR-320a 和miR-324-3p为高表达，其建议可用异常表达的miRNA来辅助肝癌的诊断。此外，Sato等[12]发现异常表达的miRNA谱可用于预测肝癌术后切除的复发情况。以上结果表明从肝癌中异常表达的miRNA入手可能有助于阐明肝癌的发病机制，但目前miRNA异常表达对肿瘤恶性行为的影响仍处于初步阶段。

miR-634为新发现的肿瘤抑制因子，已证实在多种恶性肿瘤患者的组织和血浆中低表达，如张永海等[13]发现与对照组相比，膀胱癌患者血浆miR-634水平下调，与正常水平相比降低了约61%。Peng等[8]发现miR-634参与了鼻咽癌细胞的紫杉醇耐药，如鼻咽癌紫杉醇耐药株CNE-1/Taxol中的miR-634水平高于亲本CNE-1细胞。本研究发现肝癌细胞中的miR-634水平低于正常人肝细胞系L-02，且肝癌组织中的miR-634水平亦低于匹配的癌旁组织，以上结果表明miR-634低表达可能参与了肝癌的发生发展过程。为探讨miR-634在肝癌防治中的价值，本研究进一步探讨miR-634表达与肝癌临床病理参数的关系，结果显示miR-634水平与肿瘤直径、分化程度、BCLC分期、门静脉癌栓及肝外转移均有关，且恶性程度越高则miR-634水平越低，表明miR-634水平可能参与了肝癌恶变、生长及侵袭转移过程，在肝癌调控中亦发挥抑癌基因的作用。

多项研究表明miR-634参与了肿瘤细胞的恶性表型转化，如Cong等[7]同样发现miR-634可抑制宫颈癌细胞的增殖并诱导其凋亡，其推测可能与miR-634靶向抑制mTOR信号通路有关，Peng等[8]发现该miRNA可抑制鼻咽癌细胞的增殖。鉴于本研究检测的5株肝癌细胞株中，SMMC7721的miR-634水平最低，故选取SMMC7721细胞用于验证miR-634对肝癌增殖、凋亡及侵袭的影响。本研究在转染后观察miR-634水平变化发现，在24～96 h时间窗内转染组的miR-634水平逐渐升高，提示质粒构建成功，可用于后续观察。过表达miR-634可明显抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，同时可诱导细胞凋亡，确定了miR-634在肝癌调控中发挥抑癌基因的作用，推测可能与miR-634可激活线粒体凋亡途径来促进凋亡有关。此外， Fujiwara等[6]在鼻咽癌细胞株中发现miR-634表达可提高提高化疗诱导的细胞毒性，对于化疗增敏有一定价值，下一步本研究将验证miR-634对肝癌细胞化疗是都有增敏效果。以上结果表明miR-634在恶性肿瘤中发挥较广的抑制作用，为恶性肿瘤的基因治疗提供了有力依据。

综上所述，肝癌细胞和肝癌组织中miR-634的表达水平均降低，且肝癌组织中miR-634水平与临床病理参数有关，采用基因手段上调miR-634水平可抑制肝癌细胞增殖及侵袭并诱导凋亡，在肝癌防治中有较大潜能，对于肝癌防治有重要借鉴价值，但需在动物实验中进一步验证。

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[收稿2015-11-05修回2015-11-17]

(编辑许四平)

Expression of miR-634 in hepatocellular carcinoma and its effect on biological behavior of Hepatocellular carcinoma cells

LI Fei，LI De-Xin,ZHOU Guang-Peng.The East ward of Sichuan Provincial People′s Hospital of Hepatobiliary Surgery,Chengdu 610101，China

Objective:To detect the expression level of microRNA-634 (miR-634) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its regulatory effect on the common biological behavior of hepatocellular carcinoma cells. Methods: Real-time fluorescence quantitative PCR (RT qPCR) method was used to detect HCC cell lines (HepG2, SMMC7721, BEL7402, bel7404, SNU739), 69 cases of HCC tissues and matching relative quantification of miR-634 paracancerous tissues and analysis of relationship between miR-634 expression and HCC patients gender, age, tumor size, degree of differentiation, child Pugh classification, BCLC staging, portal vein tumor thrombus and liver metastasis, while building a miR-634 eukaryotic expression vector and transfected into hepatocellular carcinoma cell lines, using live cell counting kit-8 CCK-8, flow cytometric annexin V/PI double staining and Transwell experiment to detect the transfection miR-634 on cell proliferation, apoptosis and invasion effects.Results: Compared with the normal human liver cell line L-02 and hepatocellular carcinoma cells miR-634 were decreased (P<0.05), the expression followed by HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721;69 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) of miR-634 level (0.253±0.019) and lower than that of the matched paracancerous tissues (P<0.05), and related with the tumor size, degree of differentiation, BCLC stage, portal vein tumor thrombus and liver metastasis (P<0.05). Over expression in the transfected group 24-96 h after miR-634 level continues to rise, control group and blank vector transfected group differences were statistically significant (P<0.05);and the control transfection group and blank group compared to transfection proliferation inhibition rate, apoptosis rate was increased, but wear the number of cell membrane decreased, the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: miR-634 in hepatocellular carcinoma tissues and cells were low expression and related to clinical pathological parameters, raised its level can inhibit the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells and induce apoptosis, for the prevention and treatment of liver cancer has an important reference value.

Hepatocellular carcinoma;miR-634;Proliferation;Invasion;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.017

R735.7文献标志码A

1000-484X(2016)08-1160-05

李飞(1972年-)，男，主治医生，主要从事肝胆胰腺外科,E-mail:lllfff_14@sina.com。