黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞自噬相关基因表达的影响①

于红红　吴玛莉　张智伟　陈　瑞　吴　云　段智璇　田维毅

(贵阳中医学院,贵阳550002)



黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞自噬相关基因表达的影响①

于红红吴玛莉②张智伟③陈瑞吴云段智璇田维毅

(贵阳中医学院,贵阳550002)

①本文为贵州省委组织部人才办特助项目(TZJF-2009年39号)、贵州省科技厅国际科技合作项目(黔科合外G字[2010]7014号)、贵阳中医学院2015年博士科研启动基金项目。

②贵州省疾病预防控制中心，贵阳550002。

③北京市丰台中西医结合医院，北京100072。

目的：考察黄连解毒汤含药血清对RAW264.7巨噬细胞自噬的影响，初步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法：采用大、中、小剂量黄连解毒汤水煎剂灌胃干预SD大鼠，制备含药血清；经MTT法观察含药血清对细胞增殖的影响后，选择各剂量浓度为20%的含药血清干预体外培养的巨噬细胞，采用荧光定量PCR方法检测自噬相关基因Beclin1和mTOR的mRNA表达水平；Western blot检测Beclin1、p-mTOR蛋白的表达变化。结果：与正常对照组血清相比，黄连解毒汤含药血清干预后诱导了Beclin1 mRNA及蛋白的表达，抑制了mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表达。结论：黄连解毒汤含药血清可诱导RAW264.7巨噬细胞自噬相关基因Beclin1的表达、抑制mTOR的表达，这可能是该方抗动脉粥样硬化作用的重要机制之一。

黄连解毒汤；自噬；RAW264.7巨噬细胞；动脉粥样硬化；Beclin1； mTOR

自体吞噬(Autophagy，简称自噬) 是由溶酶体介导的降解胞质内受损的细胞器或蛋白质的代谢过程[1]。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是动脉管壁内膜的一种慢性炎症性疾病，血管壁产生粥样斑块为其特征。近年研究发现细胞自噬与AS紧密相关，自噬参与并调控着AS的发生、发展进程[2，3]。研究表明适度的细胞自噬通过降解细胞内受损的结构起到抑制AS的形成和发展的作用[4]。

黄连解毒汤载于《外台秘要》，是传统的清热解毒方剂，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，具有泻火解毒的功效。临床实践和实验研究方面的数据表明,黄连解毒汤能通过多途径、多环节、多靶点整合起效干预和防治AS及稳定斑块的作用,相关的作用机制与其抗炎、降脂、保护血管内皮细胞、改善血液流变学、抑制血管平滑肌细胞增殖、调节巨噬细胞分化、调节纤溶系统、抗氧化应激等作用有关[5-9]，但其作用机制尚未完全明了。我们猜想黄连解毒汤具有的抗AS活性机制是否与调控AS相关的细胞自噬有关？作为清热解毒传统方剂，黄连解毒汤能否诱导巨噬细胞发生自噬，以及能否通过自噬表现出抗AS效应，国内外尚未见相关文献报道。本研究采用血清药理学方法观察黄连解毒汤对RAW264.7巨噬细胞自噬相关基因及其蛋白的影响，并初步探讨其部分调控机制，为临床应用黄连解毒汤治疗AS积累实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与动物小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购自American Type Culture Collection(ATCC)。制备含药血清选用清洁级雄性SD大鼠，体重180～220 g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司[生产许可证号:SCXK(军)2012-0011]。

1.1.2药物与试剂黄连解毒汤按《外台秘要》原方配伍比例(黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、栀子9 g)组方，所有中药材一次性购自北京同仁堂贵阳店同一批次，并经学院生药实验室专家鉴定为正品。采用常规方法制备水煎液[10]，并将其加热浓缩至含生药1 g/ml浓度。胎牛血清购自美国HyClone，Trizol购自美国 Invitrogen，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司，Beclin1、p-mTOR抗体及内参抗体β-actin均购自Cell signaling Technology，HRP标记的二抗购自北京中杉金桥，MTT试剂盒购自碧云天生物技术研究所，PCR反应引物由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1制备黄连解毒汤含药血清将实验大鼠适应性喂养3 d后，将其随机分为大/中/小剂量3个给药组，另设一个正常对照组，每组10只。以成人(体重以60 kg计)每日用药量的等效剂量(粗略按7倍用药量换算大鼠等效剂量)为大鼠给药小剂量，中剂量为小剂量的2倍，大剂量为中剂量的2倍，给药体积为1 ml/100 g(大鼠体重)；正常对照组给予等体积生理盐水灌胃。2次/d，连续7 d。末次给药2 h后股动脉采血，离心后制备各组血清。

1.2.2细胞培养RAW264.7巨噬细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，置37℃、5% CO2培养箱中恒温孵育。每2～3 d用Accutase细胞消化液以1∶2或1∶3的比例传代。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.3MTT法检测黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞增殖的影响用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整巨噬细胞浓度为1×105个/ml，于96 孔板中加入细胞悬液100 μl/孔，按正常对照组血清、黄连解毒汤大剂量组含药血清分别加入10%、20%、30%、40%、50%和60%浓度的正常血清和含药血清，全部加样均设8个复孔。置培养箱中培养24 h后每孔加入MTT 10 μl，继续孵育4 h，再每孔加入100 μl Formanzan溶解液混匀，4 h后采用酶标仪570 nm处测定吸光度。

1.2.4实时荧光定量PCR检测巨噬细胞Beclin1、mTOR mRNA的表达用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整巨噬细胞数为5×105个/ml，于6孔板中加入细胞悬液1 ml/孔；放置培养箱中培养4 h贴壁后，按正常对照组血清、黄连解毒汤含药血清大、中、小剂量组分别加入20%浓度的正常血清和含药血清。置培养箱中继续培养24 h后，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，并逆转录合成cDNA。用实时荧光定量PCR检测各目的基因，采用2-△△Ct方法计算其表达量。PCR反应扩增条件为95 ℃ 30 s，循环1次；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，循环40次。Beclin1 引物序列：上游5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT-3′；mTOR引物序列:上游5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3′,下游5′-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3′；GAPDH 引物序列：上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.5Western blot检测巨噬细胞Beclin1和p-mTOR蛋白的表达收集各组细胞，用RIPA裂解液裂解收集蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。等量样品经SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白分离后转至PVDF膜上。室温下封闭2 h，加各目标分子特异性一抗4℃孵育过夜，次日TBST液洗涤膜3次，加入HRP标记的相应二抗室温孵育1 h。TBST液洗膜3次，ECL法显影，用ChemiDocXRS化学发光成像系统显色、曝光采图，使用Image J软件分析条带灰度值。

2　结果

2.1黄连解毒汤含药血清对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响与正常对照组血清相比，黄连解毒汤含药血清在10%～40%浓度范围内,其OD值差异无显著性(P>0.05)。根据含药血清对巨噬细胞增殖的影响，选择对细胞数量稳定的血清浓度范围(40%以下)进行后续实验，在本实验中统一采用文献常用的20%终浓度的血清加样检测相关指标。

表1　不同浓度黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞增殖的影响±s,n=8)Tab.1　Effects of different concentrations of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on macrophages proliferation

Groups10%20%30%40%50%60%Controlgroup0.237±0.0140.252±0.0180.256±0.0130.264±0.0270.252±0.0260.265±0.031Largedosegroup0.240±0.0150.248±0.0260.250±0.0130.261±0.0050.197±0.0161)0.192±0.0202)

表2　黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞Beclin1和mTOR mRNA表达的影响Tab.2　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and mTOR mRNA expression of macrophages ±s,n=6)

表3　黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞Beclin1和p-mTOR蛋白表达的影响±s,n=6)Tab.3　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and mTOR protein expression of macrophages ±s,n=6)

图1　黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞Beclin1和p-mTOR蛋白表达的影响Fig.1　Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on Beclin1 and p-mTOR protein expression of macrophagesNote: A.Control group;B.Small dose group;C.Middle dose group;D.Large dose group.

结果见表1。

2.2黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞Beclin1和mTOR mRNA表达水平的影响与正常对照组血清相比，黄连解毒汤各剂量组含药血清作用于RAW264.7巨噬细胞24 h后，Beclin1 mRNA表达水平上调，而mTOR mRNA的表达受到抑制(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

2.3黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞Beclin1和p-mTOR蛋白表达水平的影响与正常对照组血清相比，随着黄连解毒汤含药血清作用剂量的增加，Beclin1蛋白的表达水平均受到明显上调(P<0.05或P<0.01)；p-mTOR(ser2448)蛋白的表达均受到不同程度的抑制(P<0.01)。结果见表3，图1。

3　讨论

自噬是细胞利用溶酶体系统降解自身受损的细胞器、细胞毒性蛋白的过程，使其能够适应各种应激和饥饿等环境[1，11]。自噬异常能导致多种疾病的发生，其与AS的发生发展过程密切相关。在AS进程的不同阶段中均存在自噬活性的改变，研究资料显示适度的自噬对AS具有保护作用，能够抑制AS的发生和发展。近年来，越来越多的研究显示一些传统中药及其有效成分具有诱导细胞自噬的作用[12-14]，研究者们试图从细胞自噬的角度阐释某些中药发挥作用的分子机制。因此，若能有效调控细胞自噬，将有可能为AS的防治提供新的治疗策略和靶点。

细胞自噬发生的整个过程是受一系列自噬相关基因(Autophagy related gene，ATG)所调控。Beclin1是酵母自噬基因ATG6在哺乳细胞中的同源蛋白，参与自噬体的形成，其表达强度与自噬活性紧密相关[15]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在转录和自噬体形成水平诱导自噬，现已明确在自噬的调控中扮演重要角色，负性调控着细胞自噬[16]。在本实验中，荧光定量PCR结果显示：与正

常对照组血清相比，不同剂量浓度的黄连解毒汤含药血清均能诱导Beclin1 mRNA表达，抑制mTOR mRNA表达。Western blot 结果显示：与正常对照组血清相比，黄连解毒汤含药血清干预RAW264.7巨噬细胞后Beclin1的蛋白表达水平上调；p-mTOR(ser2448)蛋白的表达均受到明显的下调。

综上所述，黄连解毒汤含药血清可诱导RAW264.7巨噬细胞自噬相关基因Beclin1的表达、抑制mTOR的表达，这可能是该方抗AS作用的重要机制之一。这一研究结果为进一步探讨黄连解毒汤的作用机制及其在抗AS中的作用积累实验依据。目前自噬与AS的关系以及自噬的调控机制尚未完全清楚，需要进一步、更深入的研究为AS的治疗提供新的途径和靶点。

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[收稿2016-01-06修回2016-03-04]

(编辑张晓舟)

Effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum on expressions of autophagy related gene in macrophages

YU Hong-Hong,WU Ma-Li,ZHANG Zhi-Wei,CHEN Rui,WU Yun,DUAN Zhi-Xuan,TIAN Wei-Yi.Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550002,China

Objective:To investigate the effects of Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum for the autophagy of RAM264.7 macrophages，and to explore its possible anti-atherosclerosis mechanism．Methods: The SD rats were intervened with large,middle and small dose Huang-Lian-Jie-Du-Decotion to prepare containing drug serum.Cell proliferation was tested by MTT assay.The gene and protein expressions of Beclin1，mTOR was assessed by fluorescent quantitative PCR and Western blot method．Results: Compared with the normal serum group,Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum enhanced expression of the mRNA and protein level of Beclin1,and decreased the expression of mTOR and p-mTOR(P<0.05 orP<0.01)．Conclusion: Huang-Lian-Jie-Du-Decotion containing serum could regulate the expressions of Beclin1 and mTOR.These might be one of the mechanisms for preventing atherosclerosis.

Huang-Lian-Jie-Du-Decotion;Autophagy;RAM264.7 macrophages;Atherosclerosis;Beclin1;mTOR

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.014

R392文献标志码A

1000-484X(2016)08-1150-04

于红红(1987年-)，女，助理实验师，主要从事中西医结合基础研究，E-mail:731319210@qq.com。

及指导教师：田维毅(1972年-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事中西医结合基础研究，E-mail:tianweiyi1972@sina.com。