鼻咽癌MKK4蛋白表达与-1044A/T多态性的相关性分析①

鲁明骞　孔庆志　许新华　卢宏达　赵华山　周　刚　徐冰清　郭　蓉

(三峡大学第一临床医学院肿瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民医院肿瘤内科，宜昌443000)



鼻咽癌MKK4蛋白表达与-1044A/T多态性的相关性分析①

鲁明骞孔庆志②许新华卢宏达②赵华山周刚徐冰清郭蓉

(三峡大学第一临床医学院肿瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民医院肿瘤内科，宜昌443000)

①本文为湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB675)、湖北省教育厅重点项目(D20141205)和2012年宜昌市科技研究与开发项目(A12301-03)。

②武汉市中心医院&武汉市肿瘤研究所，武汉430061。

目的：探讨鼻咽癌组织中MKK4蛋白的表达与-1044A/T多态性的相关性。方法：90例鼻咽癌患者，运用免疫组化法测定MKK4蛋白的表达，以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测其基因-1044A/T位点单核苷酸多态性。结果：鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达(-)为24.4%(22/90)，(+)为15.6%(14/90)，(++)为34.4%(31/90)，(+++)为25.6%(23/90)。低表达(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；高表达患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表达与高表达发生T基因变异无统计学意义(Z=0.323,P=0.747)。结论：MKK4蛋白表达的高低与-1044A/T启动子基因多肽性无明显相关性。

鼻咽癌；MKK4蛋白；1044A/T；多态性

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)好发于我国南方各省，世界上80%的鼻咽癌患者发生在中国，占头颈部恶性肿瘤的首位[1]。鼻咽癌的发生受多重因素的影响，其中信号传导在鼻咽癌的发生和发展中具有重要的作用，MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)作为丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号传导通路的组成部分，在受到外界因素刺激后，能将细胞外信号传导至细胞内，对肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡和转移等有一定的调节作用[2-4]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)在恶性肿瘤的发病、治疗与预后等方面的研究是目前的热点，目前关于MKK4启动子区-1044A/T多态性与鼻咽癌的关系尚未见相关报道，本研究将探讨鼻咽癌MKK4蛋白的表达与其启动子区1044A/T多肽性的关系，为鼻咽癌的早期发现、早期诊断和早期治疗等提供一种分子理论依据。

1　材料与方法

1.1一般资料收集2009年1月至2014年12月我院鼻咽癌患者90例，其中男性54例、女性36例，年龄22～73岁，平均年龄(45.3±5.2)岁。病理科有完整的石蜡组织标本，同时抽取患者外周静脉血2 ml待测。

1.2方法

1.2.1将石蜡组织标本制备成4 μm厚的连续切片，经脱蜡、水化、高温高压抗原修复后，滴加MKK4单克隆抗体(1∶80) (购于杭州华安生物技术有限公司)，4℃过夜，37℃复温45 min，PBS洗涤2 min，共3次，滴加生物素化二抗，37℃ 20 min，PBS洗涤2 min，共3次，加试剂SABC，37℃作用20 min，PBS洗涤5 min，共4次，加用DAB显色剂，然后在显微镜下进行观察。阴性对照以PBS代替。

1.2.2MKK4基因-1044A/T基因型测定采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定MKK4-1044A/T (rs3809728)的基因型，外周静脉血2 ml，离心(10 000 r/min×10 min)后取白细胞的沉淀，用QIAGEN公司的FlexiGene DNA kit试剂盒提取冻血DNA，提取样本500 μl，稀释至20～30 ng/L。自设上游引物为5′-TTGGGTTTGG AACAAGAAGG-3′(forward)，下游引物为5′-CAGCCTTGCCTAAAATGGAA-3′(reverse)。起始高温变性(94℃×5 min)，35个循环适温延伸(94℃×30 s)，低温退火(72℃×60 s)，最后扩增阶段(72℃×10 min)。用核酸内切酶TSP509 I消化扩增好的片段(65℃过夜)，然后置于2% 琼脂糖凝胶分离，随机选取2个SNP位点提纯片段10%的片段进行测序确定效果。

1.3统计学方法所有数据用SPSS13.0统计软件进行分析处理。采用直接计数法计算基因型及等位基因频率。如果方差不齐，采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

免疫组化结果表明，MKK4蛋白在鼻咽癌组织中阴性表达率为24.44%(22/90)，阳性表达率为75.56%(68/90)，其中(+)为14人，占15.56%，(++)为31人，占34.44%，(+++)为23人，占25.56%。低表达(-/+)共36例(40%)，高表达(++/+++)共54例(60%)。见图1、表1。

通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测鼻咽癌患者启动子-1044A/T基因型。采用核酸内切酶Sml I处理后，-1044TT基因型共产生了70 bp和152 bp两条带，-1044AA基因型产生了分子量为222 bp一条带，而杂合子共产生了70、152和222 bp三条带(见图2)。所有的结果均由经验丰富的实验者采用单盲法评价，随机选取2个SNP位点提纯片段10%的片段进行测序确定效果。其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。见表2。

90例鼻咽癌患者中，低表达(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表达患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表达与高表达发生T基因变异无统计学意义。Z=0.323,P=0.747，见表3。

表1　MKK4蛋白在鼻咽癌组织的表达Tab.1　MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma

表2　鼻咽癌患者启动子-1044A/T基因型情况Tab.2　Distribution of patients with nasopharyngeal carc-inoma SNP -1044A/T

图1　MKK4的免疫组化切片Fig.1　Immunohistochemical analysis of MKK4Note: A.Nasopharyngeal carcinoma tissue;B.Chronic inflammation nasopharyngeal tissue.

表3　1044A/T基因型与蛋白表达的关系Tab.3　1044A/T relationship with expression of differe-nt genotypes

图2　MKK4 -1044A>T 基因扩增产物凝胶电泳结果Fig.2　Result of PCR-RFLP for MKK4 -1044A T gene

3　讨论

鼻咽癌是头部最常见的恶性肿瘤，好发于我国及东南亚国家，尤其以广东省最多见，发病率达20/10万～30/10万，而欧洲、北美洲和大洋洲国家的发病率较低，低于1/10万[1]。鼻咽癌的发生与EB病毒感染、化学和遗传因素等有关，由于这些细胞外信号的刺激，可激活蛋白激酶，如MAPK、蛋白激酶C、蛋白激酶A、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CAMK)等等。目前研究认为MAPK信号传导通路是最重要的蛋白激酶信号传导通路之一，而MKK4作为MAPK信号传导通路的重要组成部分，可能是多种上游致癌应激信号途径的汇聚点，是癌基因Ras信号传导通路的中心环节，对细胞的增殖、炎症反应、细胞凋亡起着非常重要的调节作用[5]，能同时磷酸化并激活JNK通路和p38通路。MKK4蛋白的表达高低与多种恶性肿瘤恶性程度相关[6-8]，有研究认为MKK4在胃癌中表达越高，其无复发生存及总生存率越低[9]，但有学者在乳腺癌及胰腺癌的研究中，却得到了相反的实验结果[10，11]。本研究的结果显示，鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达(-)为24.44%(22/90)，(+)为15.56%(14/90)，(++)为34.44%(31/90)，(+++)为25.56%(23/90)，低表达(-/+)共36例(40%)，高表达(++/+++)共54例(60.00%)，前期结果研究发现在有淋巴结转移、分化程度较差的组织中的MKK4蛋白的表达率明显低于无淋巴结转移、分化程度相对较好的组织，具有统计学差异(P<0.05)[12]。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)是由于单个碱基的转换、缺失和插入，导致的在不同个体间的可检测的DNA序列中单个碱基的差异[13]。癌基因、抑癌基因、基质金属蛋白酶、细胞因子及其受体等相关基因的SNP变化均与恶性肿瘤有着明显的相关性，而这些多态性的研究最常见的是关于基因启动子区域的探索。目前研究发现MDM2 SNP309T/G、Fas-SNP 1377G/A和FasL-SNP 844T/C、SNP-1298A/C、1304A/T等基因多态与鼻咽癌的发病风险相关，特别是在早期及吸烟患者中更明显[14-16]。而SNP-139 GG、-939 AA和-1082 A/G多态性与鼻咽癌的遗传易感性相关[17]。Farhat等[18]在-18启动子SNP-607 C/A 和-137 G/A多态性研究发现其多态性的变化对鼻咽癌的发生和发展具有重要的促进作用。本研究通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测90例鼻咽癌患者启动子-1044A/T基因型，其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。MKK4蛋白低表达(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表达患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表达与高表达发生T基因变异无统计学意义(Z=0.323,P=0.747)。本研究发现对于多态性位点-1044AT,携带-1044AA、-1044AT及-1044TT各基因型鼻咽癌患者与MKK4蛋白表达含量的差别无统计学意义。

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[收稿2015-10-20修回2016-03-17]

(编辑张晓舟)

Correlation between MKK4 protein expression and -1044A/T polymorphism in Nasopharyngeal carcinoma

LU Ming-Qian,KONG Qing-Zhi,XU Xin-Hua,LU Hong-Da,ZHAO Hua-Shan,ZHOU Gang,XU Bing-Qing，GUO Rong.Three Gorges University Oncology Institute,the First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Department of Oncology,Yichang Central People′s Hospital,Yichang 443000,China

Objective:Discussion MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and -1044A/T polymorphism correlation.Methods: 90 patients with nasopharyngeal carcinoma,MKK4 protein expression was determined by immunohistochemical staining,polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) to detect the gene -1044A/T sites monocytes nucleotide polymorphism.Results: MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma (-) was 24.4% (22/90),(+) was 15.6% (14/90),(++) was 34.4% (31/90),(+++) was 25.6% (23/90).Low expression (-/+) patients with a total of 36 cases,-1044AA genotype accounted for 22 cases (61.11%),AT genotype accounted for 12 cases (33.33%),TT genotype accounted for two cases (5.56%),AT + TT gene type accounted for 14 cases (38.89%).The patients with high MKK4 expression of 54 cases,of which accounted for 38 cases of AA genotype (70.37%),AT genotype accounted with 15 cases (27.78%),TT genotype accounted for one case (1.85%),AT + TT genotype accounted for 16 cases (29.63%).Low expression and high expression of T gene mutation occurs no significant (Z=0.323,P=0.747).Conclusion: MKK4 protein expression correlated with -1044A/T gene promoter polymorphisms was no significant correlation.

Nasopharyngeal carcinoma;MKK4 protein;1044A/T；Polymorphism

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.011

R739.62文献标志码A

1000-484X(2016)08-1137-04

鲁明骞(1973年-)，男，博士，副主任医师，主要从事肿瘤中西医结合临床及基础研究。

及指导教师：孔庆志(1952年-)，男，教授，博士生导师，主要从事肿瘤中西医结合临床及基础研究。