免疫调节剂CH2b对葡萄糖-6-磷酸异构酶混合肽段诱导的类风湿性关节炎小鼠的影响①

刘嘉琳　张雪娇　杨　飞　娄永富　孟　明　陈冬志②

(河北大学基础医学院，保定071000)



·基础免疫学·

免疫调节剂CH2b对葡萄糖-6-磷酸异构酶混合肽段诱导的类风湿性关节炎小鼠的影响①

刘嘉琳张雪娇杨飞娄永富③孟明③陈冬志②③

(河北大学基础医学院，保定071000)

①本文为国家自然科学基金(NSFC)(81373197)、河北省自然科学基金(H2014201133，H2015201131)、河北大学医学学科建设基金(2014A1001，2014A1002)和国家级大学生创新项目基金(201510075030)。

②河北大学医学部，保定071000。

目的：探究前期合成的含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂CH2b对葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段诱导的类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)小鼠发病的影响。方法：hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段与完全弗氏佐剂充分乳化后，于DBA/1小鼠尾根部多点皮下注射，并用百日咳毒素加强免疫。然后分别用α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)和CH2b对模型小鼠进行干预，监测各组小鼠体重变化和足踝关节肿胀变化情况，关节组织苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色法观察炎细胞浸润情况，流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测全血中iNKT细胞频率变化，微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric bead array，CBA)检测血清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ水平。结果：与GPI混合肽段诱导的模型组相比，α-GalCer和免疫调节剂CH2b均可显著改善模型小鼠的体重增长缓慢、关节肿胀情况(P<0.05)；炎性细胞浸润减少；且二者均可以显著提高RA小鼠体内iNKT细胞的频率，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；α-GalCer、CH2b组可以降低模型小鼠炎症高峰期TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，两组结果差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：免疫调节剂CH2b通过激活iNKT细胞影响炎性细胞因子的分泌，缓解GPI混合肽段诱导的关节炎。

免疫调节剂CH2b；α-GalCer；葡萄糖-6-磷酸异构酶；iNKT细胞

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种病因复杂的慢性自身免疫性疾病，可累及全身关节和多脏器，其发病基础是免疫失衡和过度炎症反应。iNKT(invariant nature killer T,iNKT)细胞是近年发现的一群特殊细胞群，兼具NK细胞功能和T细胞特点，在肿瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病中发挥强大作用[1,2]。一方面，直接发挥杀伤作用于靶器官，另一方面，通过分泌细胞因子和趋化因子[3]，发挥致炎或抑炎双向功能，纠正免疫平衡，维持免疫耐受，发挥免疫调节，是链接固有免疫和适应性免疫的桥梁，被誉为免疫系统的“瑞士军刀”[4]。已有研究表明，RA患者体内存在iNKT细胞频率、功能的缺陷，治疗后可随病情的缓解而恢复[5]，且iNKT细胞频率变化与患者体内IFN-γ/IL-4比值呈负相关[6]。本课题组前期设计合成的类核苷衍生物含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂CHs在体外实验中能显著促进iNKT细胞增殖和杀靶活性[7,8]，降低IFNγ/IL-4 比值，并可以激活转录因子GATA-3 使iNKT分化倾向Th2优势[6]。

葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)是广泛应用于临床RA诊断及判断活动性的一个常用检测指标，抗原rhGPI诱导的关节炎在CD4+T细胞的依赖性和抗TNF-α、IL-6反应性方面更加接近RA患者特点，是一种新型的关节炎模型[9]。Lisa[10]认为GPI325-339和GPI469-483作为GPI的活性片段，诱导DBA/1小鼠发生关节炎，但单肽段的效果不如整个GPI蛋白。我们前期预实验发现混合肽段诱导效果强于单一肽段，且相比整个蛋白更加经济、易得。Horikosh[9]应用iNKT细胞经典激活剂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)干预GPI诱导的关节炎小鼠，小鼠症状得到缓解。本实验旨在研究免疫调节剂CH2b对葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段诱导的RA小鼠的体内作用效果，以α-Galcer为阳性对照，通过观察其对模型小鼠体重、关节肿胀程度、足踝关节组织病理、外周血iNKT细胞频率、血清细胞因子的影响，为后续RA靶向治疗提供新的科学依据。

1　材料与方法

1.1实验材料、试剂

1.1.1动物DBA/1小鼠60只，雄性，8周，体重(20±1)g，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。

1.1.2试剂与仪器化合物CH2b由本课题组前期合成；多肽片段hGPI325-339(IWYINCFGCETHA ML)、hGPI469-483(EGNRPTNSIVFTKLT)由北京赛百盛基因技术有限公司合成(1407182)；百日咳毒素(P7208)和完全弗氏佐剂(Complete freund′s adjuvant，CFA，F5881)为美国Sigma公司产品；α-Galcer为ENZO Life Sciences公司产品；FITC标记的CD4抗体(553046)、微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒(560485)、红细胞裂解液(555899)为美国BD公司产品；PE标记的T-selected-CD1d Tetramer日本MBL公司产品；BSA为Mp biomedicals New Zealand(MP Biomedicals)公司产品；PBS 为Solarbio公司产品；荧光倒置显微镜为 TH4-200，日本Olympus 公司产品；流式细胞仪Calibur、Accuri C6为BD 公司产品。

1.2实验方法

1.2.1实验分组DBA/1小鼠，随机取出15只作为健康对照组；45只小鼠进行混合肽段人工造模：每75 μl预冷三蒸水中溶解50 μg hGPI325-339和hGPI469-483多肽片段，所得溶液与CFA等体积充分乳化为乳化剂，于小鼠尾根部150 μl/只皮下注射，0 h、48 h腹腔注射200 ng/只百日咳毒素。然后将45只小鼠随机分为3组，一组不做任何处理，为模型组；一组造模当日应用α-GalCer(2 μg/只)尾根注射，为α-GalCer组；剩下一组用CH2b(2 μg/只)连续腹腔注射7 d，为CH2b组。

1.2.2小鼠一般状况评估造模后监测小鼠体重动态变化，每4 d称量小鼠体重；每天观察小鼠足踝红肿程度，对小鼠关节红肿程度量化，进行系统评分，其标准为：1分表示足趾有轻度红肿；2分表示明显可见的足背、足掌红肿；3分表示足踝出现红肿，依此评估每只小鼠关节情况。

1.2.3小鼠关节组织HE染色造模后第8天、第14天、第37天小鼠眼球取血，备用。断颈椎处死置于75%乙醇中，剪下鼠爪后置于10%福尔马林溶液中固定。然后进行脱水、透明、石蜡包埋切片(5 μm)，二甲苯(Ⅰ 、Ⅱ)脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水洗。然后苏木素染色15 min，水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水返蓝15 min，水洗，1%乙醇伊红染色3 min。脱水、透明、封固，显微镜下观察。

1.2.4小鼠iNKT细胞频率检测预先处理CD1d四聚体：0.5%Tween-20和0.9%NaCl将1 mg/ml的α-GalCer稀释至200 μg/ml，每100 μl CD1d Tetramer中加入5 μl稀释后的α-GalCer，室温孵育12 h，置4℃备用。将各期小鼠所得全血120 μl/只于流式管中，用BSA阻断非特异性染色，FITC标记的Anti-CD4、PE标记的负载α-GalCer的CD1d四聚体各2 μl，避光孵育20 min。然后加红细胞裂解液1 ml，避光孵育8 min，澄清透亮后离心1 000 r/min，5 min，弃上清，PBS洗涤2次，重悬后加PBS 500 μl，流式细胞仪Calibur上机检测，FlowJo软件(Tree Star公司)数据分析。

1.2.5CBA检测细胞因子收集各期小鼠血清，应用CBA 细胞因子试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平。严格按照说明书进行操作：制备标准品，混合捕获微球，每实验管中加入捕获微球50 μl，每标准品管中加入梯度稀释好的标准品50 μl，每样本管中加入样本50 μl，然后所有管均加入 PE检测试剂50 μl，避光孵育2 h(室温)，每管加入洗液1 ml，1 500 r/min，离心5 min，弃上清后，各加洗液300 μl，重悬，流式细胞仪Accuri C6上机检测，用FCAP软件(BD公司)进行数据分析。

2　结果

2.1CH2b对RA模型小鼠体重影响与健康对照组小鼠平均体重(22.64±1.18)g相比，模型组小鼠体重(22.03±0.26)g，较健康对照组相比增长缓慢(P<0.05)，炎症高峰阶段出现零增长、负增长。统计学分析，两组差异有统计学意义(P<0.05)。α-GalCer组平均体重(22.59±0.78)g，CH2b组平均体重(22.38±0.34)g。α-GalCer组、CH2b组小鼠相比模型组缓慢上升，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.2CH2b对RA模型小鼠关节红肿情况的影响不同处理组之间足踝肿胀与缓解程度不同，模型组小鼠造模第8天开始，一个或几个足趾出现红肿，逐日加重，第14天到达高峰，表现为多关节红肿，伴足掌、足踝肿胀，此后日渐缓解。α-GalCer组、CH2b组足踝不同程度的肿胀，均比同期模型组程度轻，利用系统评分法对小鼠关节红肿程度进行量化可以明显看出各组差异(图2、3)。

2.3CH2b对关节部位炎症浸润情况的影响HE染色后显微镜下观察发现，与健康对照组无炎细胞浸润情况相比，GPI诱导的模型组小鼠的骨与骨、骨与上皮之间的结缔组织存在大量的炎细胞浸润，其中，单核细胞较多，浆细胞和淋巴细胞量少。α-GalCer组、CH2b组，炎细胞浸润情况减轻，炎细胞数量也相对较少(图4)。

2.4CH2b对iNKT细胞频率变化的影响健康对照组iNKT细胞频率值为(0.39～0.03)%；RA模型组iNKT细胞频率为(0.10～0.71)%；α-GalCer组频率值为(1.36～0.18)%；CH2b组为(1.22～0.19)%。α-GalCer组和CH2b组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),其他各组之间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

2.5CH2b对炎性细胞因子水平的影响与健康对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平升高，在炎症高峰期上升最明显(P<0.05)。α-GalCer、CH2b组与模型组相比，TNF-α、IL-6、IFN-γ水平相对降低，在造模第14天降低最明显(P<0.05)。IL-4变化差异无统计学意义(P>0.05)(图6)。

图1　各组小鼠体重变化情况Fig.1　Change of weight in mice

图2　各组小鼠关节红肿状况Fig.2　Swelling of ankle joint in mice

图3　各组小鼠足踝关节肿胀状况评分Fig.3　Clinical score of ankle joint in mice

图4　第14天各组小鼠关节组织HE染色对比图(×100)Fig.4　Histopathological changes of ankle joint in mice on day 14(×100)

图5　各组小鼠外周血iNKT细胞频率Fig.5　Frequency of iNKT cells in peripheral blood in mice

图6　各组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平Fig.6　Levels of TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ in serum in mice

3　讨论

RA是由自身抗原诱导T、B 细胞，巨噬细胞，树突状细胞和滑膜细胞等参与免疫应答、释放炎症细胞因子介导的滑膜炎症、软骨侵蚀和关节损伤。RA个体内存在明显的免疫功能紊乱和T细胞亚群失衡：Th1、Th17亚群过度增殖，Th2、Treg亚群被抑制[11]。恒定NKT 细胞(invariant NKT cells，iNKT cells)表达恒定的TCRα链和某些β链(小鼠是由恒定的Vα14-Jα18和限制性的Vβ8.2,-7或-2链，人类为Vα24-Jα18和Vβ11链)，主要通过APC表面MHCⅠ样分子CD1d递呈的糖脂类抗原(如经典的激活剂α-GalCer)激活[12]。α-GalCer是一种从海洋生物海绵体中提取出来的脂类物质，通过与CD1d、TCR形成三联体活化iNKT细胞，迅速分泌大量细胞因子和趋化因子，参与机体的免疫应答，或维持免疫耐受[9]。研究发现，iNKT细胞与RA发病密切相关[5,6]。

GPI是临床RA诊断及判断活动性的一个常用检测指标，rhGPI抗原可诱导DBA1小鼠发生与人RA病变特点相似的关节炎症[10]。最新研究发现，该模型小鼠表现出iNKT细胞频率降低[13]，Th1和Th17炎性细胞因子过度分泌等特点[14]。

在本实验中，我们以构建GPI 混合肽段诱导的模型小鼠为基础，着重探讨免疫调节剂CH2b通过iNKT细胞对GPI诱导的RA模型小鼠的干预作用。研究结果显示：CH2b在炎症初期即开始抑制小鼠关节红肿，在模型组到达炎症高峰前，CH2b组已经开始大幅逆转炎症进展；HE染色观察发现，与模型组大量炎细胞浸润不同，CH2b、α-GalCer组炎细胞数量明显减少；炎症高峰期，FACS显示：CH2b上调iNKT的频率；血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平较模型组下降。Horikoshi等[9]研究证明，α-GalCer对GPI诱导的关节炎有治疗作用。本实验中，免疫调节剂CH2b与α-GalCer达到了相似的治疗效果：体重上调、关节肿胀缓解、关节组织间炎性细胞浸润减轻、炎症高峰期iNKT细胞频率上调、TNF-α及IL-6水平降低等。α-GalCer对自身免疫病的潜在治疗作用已在动物模型中得到确认[14，15]。但是，Parekh等[16]发现，具有超强激活力的α-GalCer可以刺激所有iNKT细胞充分活化，致使大量的Th1、Th2及Th17型因子同时释放，形成“细胞因子风暴”；而过度活化之后细胞就会长时间处于无活性状态。这种超抗原样的特性限制了α-GalCer的临床应用。因此，探索与α-GalCer激活特性不同的温和而有效的iNKT细胞激动剂成为人们的研究热点。Kerzerho等[17]报道，能降低与恒定TCR间亲和力或iNKT/APC相互作用时间的调节剂可以有助于延长iNKT细胞的寿命，保持其在体内的活化状态。我们前期合成的免疫调节剂CHs是将免疫调节剂匹多莫德所含有的特征基团——噻唑烷酮与糖类分子连接后筛选出的小分子糖类化合物，并研究了其对T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞的影响[6,8,18-22]，发现在体外实验中CHs能显著促进T细胞增殖、iNKT细胞增殖和杀靶活性，提升巨噬细胞功能，降低IFN-γ/IL-4 比值，使iNKT分化倾向Th2优势，具有全面的免疫调节活性，且对细胞无毒副作用。在本实验中CH2b在RA小鼠体内不仅发挥了与α-GalCer相似的治疗效果，而且除关节及相关免疫组织器官病理改变外，心、肺、肾、脑、胆囊、膀胱、睾丸、附睾、肾上腺均未见明显异常，提示CH2b腹腔注射后不引起其他器官的毒性反应，是一种相对理想的iNKT细胞功能调节剂。虽然免疫调节剂CH2b调节iNKT细胞具体机制还需进一步探讨，但其具有的纠正体内免疫平衡紊乱的潜在作用，使得将来应用CH2b基于iNKT细胞靶向治疗RA成为了可能。

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[收稿2015-10-28修回2016-05-16]

(编辑倪鹏)

Effects of immunostimulator CH2b on mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis

LIU Jia-Lin，ZHANG Xue-Jiao，YANG Fei，LOU Yong-Fu，MENG Ming，CHEN Dong-Zhi.College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China

Objective:To explore the effect of the synthetic immunomodulator CH2b with a thiazolidin-4-one ring on the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA) mice induced by glucose-6-phosphate isomerase(GPI) mixed peptides.Methods: hGPI325-339,hGPI469-483 peptide fragments were mixed with complete freund′s adjuvant fully,DBA/1 mice were givien subcutaneous injection of the emulsifiers,pertussis toxin to strengthen immunity.And then RA mice were intervened with α-GalCer and CH2b,the changes of body weight,ankle joint symptoms scores were observed.The joint tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) was used to evaluate the inflammatory cells.Fluorescence-activated cell sorting(FACS) was used to detect the frequency changes of iNKT cells.Cytometric bead array(CBA) was used to analyze the levels of serum cytokines TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ.Results: Compared with the model group,α-GalCer,CH2b could reduce the inflammation of the model mice,significantly improve the body weight growth and the joint swelling(P<0.05).The inflammatory cells infiltration were decreased.More importantly,CH2b improved the frequency of iNKT cells in peak,the difference was statistically significant(P<0.05).The levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ in serum were significantly decreased(P< 0.05) by CH2b.α-GalCer,CH2b could decrease the levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ,and the two groups had no statistically significant difference(P> 0.05).Conclusion: Immunomodulator CH2b by activating iNKT cells affect the secretion of inflammatory cytokines,and it relieved the GPI induced arthritis.

Immunostimulator CH2b;α-GalCer;Glucose-6-phosphate isomerase;iNKT cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.002

R392.5文献标志码A

1000-484X(2016)08-1094-05

③，E-mail:mengming127@163.com；E-mail:chenddzz@163.com。

刘嘉琳(1978年-)，女，博士，讲师，主要从事疾病动物模型的建立及发病机制的研究，同时就职于中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，E-mail:liujialin7867@126.com。