牛源金黄色葡萄球菌耐药性与耐药基因图谱的研究

常婧琦　刘璟璇

研究背景及路线

金黄色葡萄球菌是牛奶中常见的一种致病微生物，因此，能够上市的牛奶产品中不允许检出金黄色葡萄球菌。生鲜乳中金黄色葡萄球菌主要来源是奶牛场。虽然奶牛场会定时对奶牛本身和牛舍进行消毒，但还是避免不了金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染，这主要是因为金黄色葡萄球菌对牛场中使用的抗生素产生了耐药性。经查阅文献得知，金黄色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，奶牛患乳房炎是金黄色葡萄球菌污染生鲜乳最主要的原因，会引起牛奶的腐败变质。因此，想要控制牛奶的奶源质量，就必须对金黄色葡萄球菌的耐药性进行研究。我们对北京某牛场的牛群进行随机取样，对其中的金黄色葡萄球菌进行了分离鉴定，以及耐药性的基因分析，建立了多重耐药性的耐药基因图谱，可以更快速、合理地对奶牛场的用药进行指导。研究技术路线见图1。

实验过程

样品采集

从北京某牛场牛群中随机选择奶牛48头，分别收集乳头涂抹样品（见图2）、牛乳样品及粪便样品等144份样品，将其放入冰盒中冷藏，带回实验室，保存备用。其中，乳房涂抹样品：使用无菌拭子擦拭奶牛乳头后置于无菌生理盐水中保存，共采集48份；生鲜乳样品：用温水清洗奶牛乳房并使用75%酒精棉球对乳头进行消毒处理，然后收集第3把后的奶样保存于无菌试剂瓶，共采集48份；粪便样品：使用无菌手套从牛的肛门处采集新鲜粪便，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中保存，共采集48份。

菌种预培养

配制营养肉汤培养基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求进行配置，再加入适量的蒸馏水。121℃20min高温湿热灭菌。在无菌室挑取平板上的菌落，放入灭菌的营养肉汤培养基中，放入培养箱中37℃进行培养。

菌种分离纯化

配制Baird Parker琼脂培养基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求进行配置，再加入适量的蒸馏水，121℃20min高温湿热灭菌，待温度冷却到50℃时，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，用于金黄色葡萄球菌的选择性分离培养。每个平板倒入大约20mL的培养基，加入已活化的液体培养基1 mL，放入培养箱中37℃进行培养。

菌体镜检和鉴定

镜检采用革兰氏染色法，一般包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤。

鉴定时，用取样棒挑取未知菌株的单菌落，悬浮于200 uL样品缓冲液中，95℃处理25min，分别加入5 uL裂解液A和裂解液B，选用EcoRI酶切程序。用全自动微生物鉴定设备运行约8h时后观察实验结果，得出待测菌株的信息。

药物敏感实验

使用比浊管对金黄色葡萄球菌肉汤培养物进行标定并校正。随后将培养物接种于营养琼脂平板中，涂布均匀后贴上药敏纸片，用镊子轻压纸片将其与培养基表面贴牢，15min内放入37℃恒温培养箱中培养48h后测量抑菌圈直径。并对金黄色葡萄球菌的耐药结果进行归类分析。

耐药基因图谱的建立

采用BioNumerics分析软件对全自动微生物鉴定结果进行分析，得出金黄色葡萄球菌的耐药基因图谱。

实验结果

培养特性

Baird Parker培养基培养24h后菌落为圆形，直径1～2mm，颜色灰或黑色，周围环晕约2～3mm。营养琼脂上培养24h后菌落为圆形，直径2～3mm，表面光滑、湿润、边缘完整，未见明显环晕。营养肉汤培养12h后液体浑浊，静止后底部有沉淀，轻摇后全部旋起溶解。

形态观察

将提纯培养的菌株进行革兰氏染色，镜检呈阳性结果。显微镜下菌株呈葡萄球状排列，边缘散落菌体呈短链状存在，不存在鞭毛、芽孢、荚膜。金黄色葡萄球菌在Baird Parker培养基上培养24h后的形态见图3。金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果见图4。

菌种鉴定结果

分别调取平板培养的单菌落，悬浮于40 uL缓冲液中，预热后加入裂解液，选用EcoR I酶，在全自动微生物鉴定系统中自动运行8h，自动酶切后得出杂交图谱，将122株疑似金黄色葡萄球菌菌株产生的条带型与鉴定数据库中的标准菌株的标准条带型进行比较，得出57株菌株为金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%。

金黄色葡萄球菌的耐药性

将从牛场取得的样品中筛选出的57株金黄色葡萄球菌进行药物敏感实验。由实验结果得知，分离得到53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性的检出率为92.9%，对氨苄西林和青霉素G耐药的比率分别高达为78.9%和77.1%，而对克林霉素、红霉素、氯霉素及四环素的耐药性较低。

金黄色葡萄球菌耐药基因图谱

使用BioNumerics生物软件对鉴定结果的图谱进行分析处理，建立金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱（见图5）。由图谱可知，5耐菌株图谱为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、氯霉素耐药的基因图谱，4耐菌株图谱为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素耐药的基因图谱，3耐菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、氯霉素耐药的基因图谱；2耐（a）菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G耐药的基因图谱；2耐（b）菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、四环素耐药的基因图谱；2耐（c）为金黄色葡萄球菌对四环素、头孢哌酮耐药的基因图谱；1耐菌株为金黄色葡萄球菌对青霉素耐药的基因图谱；0耐菌株无明显耐药性。通过金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱可以更简捷分辨出从奶牛场分离出的金黄色葡萄球菌的耐药情况，可以更快速、合理地指导奶牛场对奶牛的合理用药。

讨论与结论

讨论

目前，寻找奶牛乳房炎发病原因最常用的方法是病原菌的分离鉴定，以往的研究发现金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，本文使用全自动微生物鉴定系统针对从奶牛乳头涂抹点、牛乳、粪便等样品分离纯化的疑似122株菌株进行了快速鉴定，鉴定出57株为金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%，说明金黄色葡萄球菌是该奶牛场存在的主要致病微生物。目前治疗奶牛乳房炎的常用方法是使用抗生素，但大量抗生素的使用会使金黄色葡萄球菌产生耐药性，因此，针对分离纯化鉴定得到的57株菌株分别进行了药敏实验，结果显示，53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性检出率为92.9%，其中51株菌株具有多重耐药性，主要集中在4耐和5耐，占总菌株的64.9%，而对氨苄西林和青霉素G耐药的比率分别高达78.9%和77.1%，对克林霉素、红霉素、氯霉素及四环素的耐药性较低，说明该牛场的奶牛近期发生过乳房炎疾病且波及范围较大，在此期间使用了大量的抗生素药物，特别是青霉素类的抗生素。因此，建议奶牛场不要经常或单独使用含氨苄西林和青霉素的抗生素。

另外，对于奶牛乳房炎，除药物防治外，还应以预防为主，因此建议该牛场注意加强饲养管理、注重挤奶卫生、平衡日粮、并进行定期检测，做到早发现早治疗，从根本上降低乳房炎的发病率。此外，还要加强干奶期的预防，干奶期是奶牛泌乳周期的一个重要阶段，是对奶牛机体和乳房健康的重要调整期，也是控制和治疗乳房炎发生的重要环节，在此阶段，药物可以长时间作用于乳房，对降低下一泌乳期乳房炎发病率具有显著作用。

结论

本研究通过对从北京某牛场采集的乳头涂抹样品、牛乳样品及粪便样品等144份样品进行金黄色葡萄球菌的分离纯化，得到122株疑似金黄色葡萄球菌菌株，使用全自动微生物鉴定系统快速确定了57株金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%。耐药性实验结果表明其中53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性检出率为92.9%，而其中51株菌株具有多重耐药性，主要集中在4耐和5耐，占总菌株的64.9%。根据全自动微生物鉴定系统的结果图谱，使用BioNumerics生物软件进行图谱的分析处理，建立了金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱。因此，建议该奶牛场不要经常或单独使用含氨苄西林和青霉素的抗生素，而改用其他类抗生素，该实验方法与结果可用于指导奶牛场合理用药，以降低金黄色葡萄球菌的耐药性，保证生鲜乳的质量安全。

创新点

◇全自动微生物鉴定系统用于快速鉴定金黄色葡萄球缩短了鉴定时间，分析了奶牛场金黄色葡萄球菌的耐药情况，可快速调整奶牛场用药。

专家评语

该项目通过金黄色葡萄球菌的采集鉴定及其多重耐药性研究，建立了金黄色葡萄球菌耐药基因图谱。研究手段先进，具有较强的科学性.实用性和完整性。建议加强科学文献的学习，进一步改进实验方法，提高研究深度。