猪蓝耳病毒感染的实验室诊断

张平，马惠琴，龙冬梅，贺志昊，王芸华，杨廷军（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节551700）

猪蓝耳病毒感染的实验室诊断

张平，马惠琴，龙冬梅，贺志昊，王芸华，杨廷军
（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节551700）

2015年8月,毕节市某猪场发生一起以发病猪体温升高、母猪流产、仔猪高死亡率为特点的传染病。当地兽医根据临床症状指导用了大量的药物治疗，但效果不佳。通过流行病学调查、临床症状、剖检病变,初步诊断为疑似高致病性猪蓝耳病,为确诊病原,对病死猪的组织进行了实验室检测。通过R T-PCR试验检测，确诊为高致病性猪蓝耳病毒阳性。

猪蓝耳病病毒；实验室检测；实时荧光R T-PCR

高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）变异毒株引起的一种急性、高传染性、高致病性的疫病，目前已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。猪蓝耳病病毒于2005年发生变异后引起高致病性猪蓝耳病，发病率、致死率均显著增高。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告疫病，我国列为二类动物疫病。由于最先在欧洲的临床病例出现特有的猪的耳朵蓝灰色病变，我国学者、饲养人员和临床兽医将其简称为猪蓝耳病或蓝耳病[1-5]。该病有美洲株和欧洲株两大类型，美洲株最早在美国发现，20世纪90年代后传入我国。2015年8月,毕节市某猪场发生一起以发病猪体温升高、母猪流产、仔猪高死亡率为特点的传染病。当地兽医根据临床症状指导用了大量的药物治疗，但效果不佳。通过临床症状、剖检病变,初步诊断为疑似高致病性猪蓝耳病,综合流行病学信息、临床表现及剖检病变怀疑为猪蓝耳病病毒或猪瘟病毒感染，也可能为二者混合感染，为对该病例作出确切性诊断，特进行实验室检测。对毕节某规模猪场出现的妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况,为确诊病原，本文利用实验室实时荧光RT-PCR诊断技术，最终确诊为猪伪狂犬病毒感染引起。

一、材料与方法

（一）材料

1.病料。采集病死猪只组织（脾脏、淋巴结）放在双抗PBS溶液中，低温冷藏保存运至毕节市动物疫病预防控制中心兽医实验室。

2.主要试剂。世纪元亨猪繁殖与呼吸综合征病毒(NSP2 1594-1680变异株)检测试剂盒，猪蓝耳病病毒荧光定量PCR试剂盒。

（二）方法

1.样品的处理。取病死猪只组织（脾脏、淋巴结），用手术剪剪碎混匀后取0.5g于组织匀浆机中研磨，加入2mL去离子水，研磨均匀后离心取500μL上清液于灭菌离心管中。

2.RNA提取。按照猪蓝耳病病毒提取试剂盒说明书进行。

3.实时荧光RP-PCR检测。反应采用25μL体系，反应体系为：无菌无核酸水2.7μL，RT-PCR反应液10μL，酶混合液0.4μL，荧光探针1.9μL，RNA模板10μL。反应条件为：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步收集FAM荧光信号，共40循环（报告基因“FAM”，淬灭基团“NONE”）

二、试验结果

（一）临床症状及药物治疗情况

采样时共有13头左右发病，死亡3头。主要临床症状为:食欲不振、流产、呕吐、病程短的6～12h死亡，病程长的死亡前四肢划动，有神经症状。发病母猪有流产死胎现象腹部发红。剖检主要表现为:肺脏肉变，肝脏充血，肾脏表皮有点状出血，肠系膜淋巴结严重肿大。交替使用青链霉素、头孢类、磺胺类等药物肌肉注射治疗，使用多量维生素和干扰素混水饮用，但治疗效果不佳。

（二）实验室检测结果

经毕节市动物疫病预防控制中心采集该场病死猪样品进行分子生物学检测，结果显示，病死猪只组织均检出疑似高致

图1　PRV实时荧光RT-PCR检测结果A1：阳性对照；E1：阴性对照；B1/C1/D1：待检样品

三、讨论

猪群一旦发生高致病性猪蓝耳病后极易混合感染或继发猪瘟、圆环病毒、细菌性疾病等，特别是猪瘟，可以说是猪病的万恶之源，所以必须搞好猪瘟的预防和净化工作[6-9]。其他疾病能使用疫苗免疫预防的，按免疫程序按时开展，如果没有疫苗免疫预防的，可提前采用一些药物进行预防[10]。高致病性猪蓝耳病临床上多表现为母猪的流产和仔猪的腹泻、神经症状，仅从临床表现和剖检很难将其与有相似症状的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等区分开来，需要进行实验室检测才能确诊。本文采用分子生物学技术对流产胎儿组织进行实时荧光RT-PCR方法的检测，确诊了该次疫病由猪伪狂犬病毒引起。为今后实验室确诊猪伪狂犬病提供基础科学依据。

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［3］郭万正，陈绍柏.猪蓝耳病与猪瘟混合感染的诊治报告［J］.黑龙江畜牧兽医，2001，（9）：25-25.

［4］何海林.猪蓝耳病与猪瘟混合感染诊断的报告［J］.TechnicalAdvisorforAnimalHusbandry，2008（8）：77-77.

［5］张立成，王谢忠，马丽娅.一起猪瘟和高致病性猪蓝耳病混合感染病例的诊断报告［C］.中国畜牧兽医学会2010学术年会暨中国兽医临床大会，2010：62-62.

［6］朱意.高致病性猪蓝耳病与猪瘟混感的防制［J］.今日畜牧兽医，2015，（4）：22-23.

［7］滕秀霞，刘国华，马秀霞，等.一起猪高致病性猪蓝耳病和猪瘟混合感染疫情发生的处理和思考［J］.中国动物检疫，2011，28（6）：66-68.

［8］王玉梅，张百炼.疑似高致病性猪蓝耳病诊治［J］.中兽医医药杂志，2011，（2）：66-67.

［9］吴光明，吴卫东.一起高致病性猪蓝耳病和猪副嗜血杆菌病混合感染的诊断［J］.养殖技术顾问，2014，（10）：214-215.

［10］罗洪安.高致病性猪蓝耳病的诊断与防控［J］.广东农业科学，2009，31（5）：98-99.

（编辑：张琼琼）

S858.28

B

1673-9019(2016)13-0034-02

2016-06-06

张平（1988-），女，安徽阜阳人，主要从事兽医实验室检测工作。病性猪蓝耳病病毒核酸阳性，没有检出猪瘟、圆环病。（见图1）。由图可知病死猪组织样品DNA均呈出现特异性扩增曲线。