喷施钙对肥城桃果活性钙含量及其在亚细胞分布的影响

王 雷， 李 玲， 陈修德， 韩小虎， 王钰馨， 高东升

(作物生物学国家重点实验室， 山东农业大学园艺科学与工程学院， 泰安 271000)



喷施钙对肥城桃果活性钙含量及其在亚细胞分布的影响

王 雷， 李 玲， 陈修德， 韩小虎， 王钰馨， 高东升*

(作物生物学国家重点实验室， 山东农业大学园艺科学与工程学院， 泰安 271000)

【目的】肥城桃是山东特产，但经常发生缝合线褐变、 不耐储藏等问题，补充钙肥是减轻其生理病害的有效措施。了解肥城桃的需钙规律，为肥城桃补充钙素营养提供理论依据和技术指导。【方法】以11年生红里肥桃为试材，从花后一个月开始，每隔30 d在选取的肥桃果树上喷施钙肥。试验设3个处理: 1)喷施0.5%氨基酸钙溶液； 2)喷施0.5%硝酸钙； 3)喷施清水为对照。从4月28日起每隔30 d采样，测定果皮、 果肉、 果核、 果仁总钙含量及果肉钙组分含量，在成熟期取果实用透射电镜观察果肉细胞内钙的亚细胞分布。【结果】3个处理果实中的钙含量均以幼果期最高，随着果实的成熟，全钙、 水溶性钙、 果胶酸钙含量均呈下降趋势，喷钙处理在一定程度上提高了果皮、 果肉、 果核及果仁的总钙含量，其中果肉总钙含量变化最明显，在果实成熟期，喷施氨基酸钙及硝酸钙的处理果肉总钙含量分别增加了68%、 77%。通过电镜观察，喷钙果肉细胞中钙均匀分布于细胞壁、 细胞膜、 液泡膜上，液泡中有钙的堆积； 未喷钙细胞壁中钙的分布减少，细胞膜、 液泡膜上钙也均匀分布； 发生褐变的果肉细胞内钙分布很少且不均匀。【结论】肥城桃果实中全钙含量随着果实生长而迅速下降。喷施钙肥能提高果实全钙尤其是水溶性钙及果胶钙的含量，增加细胞壁钙的分布，有利于缓解果实发育过程中钙含量的下降。喷施氨基酸钙和硝酸钙都能增加肥城桃果肉的不溶性果胶含量，提高果实硬度。

叶面喷钙； 肥城桃； 钙动态； 钙组分； 钙亚细胞分布

肥城桃 [Prunuspersica(L.)Batschcv.Feicheng]，又名佛桃，是山东肥城特产。其外形美观，香味独特，口感极佳，栽培历史悠久，在海内外享有较高声誉。肥桃在肥城地区种植广泛，种植面积已达10万亩，是肥城市农村重要经济来源。近年来施用过多氮磷钾肥，忽视中微量元素，肥城桃果实品质有所下降，出现了不耐储藏、 缝合线褐变、 裂果等问题。钙是果树生长发育所必需的营养元素，钙不足或比例失调，常引起肥桃品质劣化、 裂果、 落果等问题[2]，桃树果实顶腐病也主要是缺钙所致[3]。许多试验证实了钙对果实生长和品质的良好作用。如采前喷钙处理能延长溶质桃货架期[5]，采后对“黄冠”梨进行浸钙处理有助于维持细胞质稳定的钙浓度，抑制细胞壁组分降解[1]，对鸭梨适度喷施硝酸钙有延长果实贮期、 推迟腐烂的作用[4]。由于根系吸收的钙难以到达果实中，叶面、 果面喷钙成为果树补充钙元素的重要措施，叶片施加不同形态的钙可以显著提高番茄高温下的光合作用[6]，Ca2+和水杨酸对亚高温条件下番茄植株叶片保护酶活性具有正调控作用[7]。针对肥城桃钙出现的问题，本研究对肥桃进行了不同形态钙肥喷施试验，并用电镜观察了钙在亚细胞的分布，为肥桃叶面喷钙提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验在肥城市西尚里村肥城桃研究所试验基地(36°18′N，116°74′E)进行，土壤为砂壤质风积黄壤土，碱解氮、 速效磷、 速效钾含量分别为43.50、 35.62、 289.91 mg/kg，有机质含量为23.72 g/kg。果树栽植密度为4 m×5 m。供试品种为11年生红里肥桃，选取生长状况良好，结果正常，且树势一致的树进行试验。

试验共设3个处理: 1)喷施0.5%氨基酸钙溶液； 2)喷施0.5%硝酸钙溶液； 3)喷清水(CK)。喷施从花后一个月开始，每隔一个月喷施一次，共喷施5次。喷施时间选在上午10点前，没有大风的情况下喷施，如果在喷施3个小时内有降雨则需要补充喷一次。喷施量以叶片正反两面滴水为止，果实表面也喷到滴水为止。

每次喷钙一周后对果实进行取样，以去离子水洗净后将果实分为果皮、 果肉、 果核及果仁，105℃杀青，75℃烘干。一部分用于测定钙含量，一部分果肉用液氨冷却后放入-80℃储存，用于测定果肉钙组分含量。收获期对果实取样，用透射电镜观察果肉细胞内钙的亚细胞定位。

1.2测定项目及方法

1.2.2 钙的亚细胞分布观察参照廖晓勇等[9]和王凤茹[10]的方法，分别将果肉及发生褐变的果肉样品切成适当大小，经含2%戊二醛和2%焦锑酸钾固定液固定24 h，再用PBS缓冲液冲洗，乙醇溶液脱水，包埋后用Leica REICHERT SUPERNOVA型切片机切成50 nm切片，用GEOL JEM-1200EX型透射电镜观察钙的亚细胞分布与细胞的超微结构。

1.3数据处理

采用Excel 2010进行数据处理，SPSS 19.0进行方差分析，Duncan 新复极差法进行结果的显著性检验。

2　结果与分析

2.1喷钙处理对果实总钙含量动态的影响

由图1可知，果实中，果皮钙含量最高，果仁居中，果核、 果肉含量最低。果实各部分钙含量随果实发育过程下降。果皮钙含量从4月28日至5月28日下降最多，喷氨基酸钙、 硝酸钙及对照分别下降了39.4%、 34.1%、 35.7%； 其次是从6月28日至7月28日，分别下降了31.0%、 24.9%、 31.0%。果肉钙含量也在4月28日至5月28日下降最多，喷施氨基酸钙、 硝酸钙处理及对照分别下降了55.3%、 57.9%、 56.9%，之后缓慢下降。果核中的钙含量从4月28日至6月28日持续下降，喷氨基酸钙、 硝酸钙及对照分别下降了57.2%、 52.6%、 48.9%，之后基本不变。果仁钙含量在6月28日前维持在较高水平，主要在6月28日至7月28日明显下降，施加氨基酸钙、 硝酸钙的处理及对照分别下降了53.5%、 57.0%、 46.7%。之后又趋于稳定。

图1　喷钙处理对果皮、 果肉、 果核、 果仁总钙含量动态的影响Fig.1　Effects of spraying calcium on total calcium contents in peel, flesh, stones and seeds of peach

喷钙能增加果实中的钙含量。成熟期喷施氨基酸钙、 硝酸钙，果皮钙含量分别增加了30.8%、 18.6%，两种钙形态之间差异不显著； 果肉钙含量喷施氨基酸钙、 硝酸钙分别比对照显著增加了68%、 77%； 果核发育初期其钙的增加效果明显高于果核发育后期，在4月28日，喷施氨基酸钙、 硝酸钙果核钙含量分别增加了38.5%、 17.9%，成熟期只增加了17.8%、 2.0%； 果仁钙含量在5月28日至6月28日期间增加效果最显著，氨基酸钙、 硝酸钙处理钙含量分别比对照提高了21.0%、 35.7%，其他时期增加不显著。

2.2喷钙对果肉不同形态钙含量的影响

由表1可以看出，果肉中不同形态的钙含量在成熟过程变化不同。水溶性钙(H2O-Ca)及果胶酸钙(NaCl-Ca)随果实生长呈下降趋势； 磷酸钙 (HOAc-Ca)含量变化呈V字型，在采收时达到最高。在果实成长过程中，各钙组分含量占总钙含量的比例也发生了变化，其中对照组果肉的钙组分中，水溶性钙占总钙含量的比例在不断下降，从5月27日的36.5%下降到果实采收时的21.5%； 果胶钙所占比例基本不变，5月27日占29.9%，采收时占30.7%； 磷酸钙、 草酸钙(HCl-Ca)、 硅酸钙(Res-Ca)占总钙的比例则有所上升，三种钙组分5月27日分别占13.1%、 16.5%、 3.97%，采收时分别上升到23.8%、 19.1%、 4.80%，喷施不同钙肥的处理也有相似的变化趋势。

在果肉的各钙组分中，水溶性钙和果胶钙含量最高，磷酸钙及草酸钙含量居中，硅酸钙含量最低。在生育期内喷钙处理均能提高果肉中各钙组分的含量。果实成熟期，喷施氨基酸钙的处理，水溶性钙、 果胶钙、 磷酸钙、 草酸钙、 硅酸钙含量与对照相比分别增加了5.2%、 11.7%、 19.6%、 7.2%、 96%。喷施硝酸钙的处理与对照相比水溶性钙、 果胶钙、 磷酸钙、 草酸钙、 硅酸钙含量分别增加了39.2%、 6.7%、 29.0%、 9.0%、 3.7%。喷施氨基酸钙的处理显著提高了果胶酸钙的含量，喷施硝酸钙的处理显著提高了水溶性钙的含量。

表1　喷钙处理对果肉钙组分含量的影响(mg/100 g)

注(Note): 同列数值后不同字母表示同一日期不同处理间差异显著(P<0.05) Values followed by different letters in a column mean significant difference among treatments on the same date (P<0.05).

2.3喷钙处理对果肉细胞内钙的亚细胞分布的影响

由图2可知，不同处理的果肉细胞钙的含量及分布有所差异。其中图2a、 b、 c为施钙处理的果肉细胞，喷钙处理的果肉细胞在细胞壁(cw)、 细胞膜(cm)、 液泡膜(t)上都有较多的钙分布，且分布比较均匀，液泡中有黑色颗粒堆积，液泡中堆积的钙可能是形成的磷酸钙、 草酸钙，而细胞质中钙的分布比较少。图2d、 e、 f为对照组果肉细胞，对照组的果肉细胞液泡膜上、 细胞膜上有较多的钙分布，细胞壁上虽然也有钙的分布，但含量比喷钙处理的果肉细胞明显变少，细胞质中钙的分布也比较少。图2g、 h为发生缝合线褐变的果肉细胞，发生褐变的果肉细胞内各部分钙含量降低，尤其是细胞壁中含量很低，且钙分布不均匀，没有规律，但是在细胞间质含有较多的钙。当钙含量较多时，果肉细胞中钙主要存在于细胞壁、 质膜上及液泡中，且分布比较均匀，而发生褐变的果肉，分布不均匀。

图2　钙处理对肥城桃果肉细胞内钙的亚细胞分布的影响Fig.2　Effect of the Ca treatments on subcellular distribution of Feicheng peach pulp cells[注(Note): 图a、 b、 c为喷钙处理的果肉细胞钙的亚细胞分布，显示在细胞壁、 细胞膜、 液泡膜、 液泡内都有大量钙的分布 Fig.a, b, c are the subcellular distribution of Ca in pulp cells after Ca supply, much more Ca contained on the cell wall(cw), cell membrane(cm), tonoplast(t) and vacuole(v); 图d、 e、 f为对照果肉细胞钙的亚细胞分布，在细胞膜、 液泡膜、 液泡内上有钙的分布，细胞壁上钙含量减少Fig.d, e, f are the subcellular distribution of Ca in CK pulp cells, Ca contained on the cell membrane(cm), tonoplast(t) and vacuole(v), and decreases of Ca on cell wall； 图g、 h为发生褐变的果肉细胞钙的亚细胞分布，细胞膜、 液泡膜上有少量钙的分布，细胞壁中钙含量减少，细胞间质有钙的分布 Fig. g, h are the subcellular distribution of Ca in browning pulp cells, showing decreases of Ca on cell membrane(cm), tonoplast(t) and cell wall(cw), contained in intercellular substance.]

2.4喷钙处理对成熟期果实品质的影响

由图3可知，喷施不同钙肥对肥城桃果实糖组分有不同的影响。喷施氨基酸钙的处理果糖、 葡萄糖、 山梨醇都高于对照，总糖比对照提高了1.97 mg/g； 喷施硝酸钙的处理蔗糖含量低于对照，其他糖组分与对照相比差异不显著，总糖含量与对照相比下降了3.68 mg/g。

由图4可知，喷施不同的钙肥对有机酸组分含量也产生了不同的影响: 喷施氨基酸钙的处理苹果酸、 柠檬酸含量有所下降，琥珀酸含量有所上升，酒石酸含量变化不大，总酸比对照降低了0.68 mg/g； 喷施硝酸钙的处理苹果酸、 琥珀酸含量有所上升，柠檬酸含量有所下降，酒石酸含量变化不大，总酸比对照提高了0.39 mg/g。

综合图3、 图4可知，喷施不同钙肥对肥城桃糖酸比也产生了一定影响: 对照组、 喷施氨基酸钙、 硝酸钙的处理糖酸比分别是35.6、 44.1、 31.3。喷施氨基酸钙的处理，总糖含量略有上升而总酸含量有所下降，糖酸比高于对照； 喷施硝酸钙的处理总糖有所下降，糖酸比低于对照。

2.5喷钙处理对成熟期肥城桃不同果胶含量的影响

由5图可知，喷钙处理的肥城桃总果胶含量与对照相比都显著增加，其中施加氨基酸钙、 硝酸钙的处理与对照相比总果胶含量分别增加了24.8%、 32.1%。喷钙后果实中不同形态的果胶含量都有所增加，喷施氨基酸钙的处理，共价结合果胶及离子结合果胶分别增加了43.5%、 43.7%，而水溶性果胶含量变化不大； 施加硝酸钙的处理水溶性果胶及离子结合果胶含量分别增加了42.8%、 37.9%，共价结合果胶含量变化不大。喷施氨基酸钙增加了共价结合果胶含量，而喷施硝酸钙处理显著提高了水溶性果胶含量，所有的喷钙处理都显著提高了果实中离子结合果胶的含量。

图3　喷施不同钙对肥城桃可溶性糖含量的影响Fig.3　Effects of spraying calcium on soluble sugar content of Feicheng peach

图4　喷施不同钙对肥城桃有机酸含量的影响 Fig.4　Effects of spraying calcium on organic acid content of Feicheng peach[注(Note): TA—Tartaric acid; Mal—Malic acid; CA—Citric acid; SA—Succinic acid; TA—Total acid.]

图5　喷施不同钙对成熟果实果胶含量的影响Fig.5　Effects of spraying calcium on pectin content[注(Note): SP—水溶性果胶Soluble pectin; CP—共价结合果胶Covalent-soluble pectin; IP—离子结合果胶Ionic-soluble pectin;TP—总果胶Total pectin.]

图6　喷施不同钙对肥城桃果实硬度的影响Fig.6　Effects of spraying calcium on hardness of Feicheng peach

2.6喷施不同钙肥对储藏期间肥城桃硬度的影响

由图6可以看出，果实的硬度在储藏过程中呈下降的趋势。喷施不同的钙处理在一定程度上提高了储藏过程中果实的硬度，在储藏过程中喷钙处理的果实硬度高于对照。到储藏30 d后硬度从大到小分别是氨基酸钙处理、 硝酸钙处理、 对照。

2.7果胶、 果肉钙含量、 果实硬度的相关性分析

进一步对果实硬度、 果胶含量及钙含量进行相关分析(表2)可知， 果实硬度、 果胶酸钙、 水溶性钙、 草酸钙、 总钙含量、 共价结合果胶含量之间都呈极显著正相关关系，表明喷钙处理对增加共价结合果胶含量及果实硬度有明显作用； 水溶性果胶与共价结合果胶、 果实硬度、 水溶性钙、 果胶钙、 总钙含量之间呈极显著负相关关系，表明当果实钙含量较低时，水溶性果胶含量增加，而共价结合果胶含量减少，果实硬度下降。可以看出，水溶性钙含量、 果胶钙含量与共价结合果胶含量及果实硬度之间的关系密切。

3　讨论与结论

3.1肥城桃果实钙含量动态

果实对钙的吸收主要集中于幼果期[12]，肥城桃果实发育具有双“S”曲线特征[11]。本研究分析结果也表明了果实钙含量变化与果实的双“S”发育进程密切相关。果实中不同部位生长最迅速的时期也是钙含量下降最快的时期，生长缓慢阶段钙含量变化也较慢。果实钙含量在幼果期达到最高值，果皮钙含量下降主要集中在果实的两次膨大期，果仁钙含量下降主要出现在种子快速发育期，果核钙含量下降出现在硬核期之前。由此可见，肥城桃果实幼果期结束后，果实对钙的吸收困难[13-15]，果实的迅速生长对钙含量有稀释的作用，果实各部位生长越迅速，稀释作用也就越强。

表2　肥城桃钙组分与果胶含量之间的相关系数

注(Note): *—在 0.05 水平上显著相关Represent significant differences atP<0.05; **—在0 .01 水平上显著相关 Represent significant differences atP<0.01.

对不同组分钙的分析结果显示，在果实发育过程中，水溶性钙所占比例不断下降，磷酸钙、 草酸钙比例有所增加，果胶酸钙所占比例较为稳定。说明随着果实的成熟，不同钙组分之间可能发生了转化，水溶性钙与果实产生的草酸、 磷酸等结合形成沉淀[16]。可溶性Ca2+在维持果肉细胞膜结构的完整性方面有重要作用[17]，而水溶性钙含量及比例的下降可能是果实发育后期易出现生理病害的原因之一。

3.2喷钙对果实钙含量的影响

喷钙能提高果肉的钙含量，尤其在果实膨大期间，钙难以进入果实，果实表面喷钙肥有助于给果实补充足够的钙。电镜观察证实，喷钙的果肉细胞壁上钙含量要高于对照，钙均匀地分布于细胞壁、 液泡膜、 细胞膜上，而发生褐变的果肉细胞，细胞壁上很少能观察到钙的分布，细胞膜上、 液泡膜上钙含量也明显降低、 分布也很不均匀。果胶酸钙是细胞壁的结构物质[18-19]，喷钙处理后果胶钙含量提高，从电镜照片也可以看出，果肉细胞壁中钙含量明显高于对照； 草酸钙和大部分磷酸钙沉淀在液泡中以维持稳定的胞质钙浓度[20]，喷钙处理的果肉细胞电镜照片中观察到液泡中有钙的沉淀，可能就是形成的草酸钙和磷酸钙沉淀； 喷钙处理的果肉细胞中钙均匀分布于质膜上，可能与水溶性钙含量的增加有关，而可溶性Ca2+可能在维持果肉细胞膜结构的完整性方面有重要作用[20]。

3.3喷钙对果实品质的影响

糖类物质及有机酸类物质含量关系到果实的口感。果实的风味即取决于糖酸含量，也取决于糖酸比。本试验中，喷施氨基酸钙和硝酸钙对肥城桃的酸甜品质影响不同。喷施氨基酸钙提高了果实中果糖含量，降低了蔗糖含量，甜度值[21]及糖酸比都高于对照，改善了果实酸甜风味； 喷施硝酸钙果实蔗糖含量有所降低，甜度值及糖酸比均低于对照，降低了果实酸甜风味。就果实风味品质而言，喷施氨基酸钙效果要优于硝酸钙。

硬度是影响果实贮运品质的重要指标，尤其对于不耐贮运的桃，硬度更是衡量其商品价值好坏的重要参数。本实验结果显示，伴随着果实的成熟，果实中不溶性果胶含量不断减少，尤其是共价结合果胶含量变化明显，而水溶性果胶含量一直在上升，不溶性果胶含量的减少会导致果实的软化。喷钙处理增加了不溶性果胶含量。钙可以与细胞壁多糖和蛋白质结合，通过不溶性果胶连接保持细胞壁的完整性，从而抑制细胞壁的降解[22-23]，喷钙处理的果实总果胶含量、 共价结合果胶含量都高于对照，有利于维持果实硬度，相关分析也表明钙和果胶含量与果实硬度之间呈极显著正相关关系。

喷钙处理还提高了果实中活性钙的含量。水溶性钙及果胶钙对于维持细胞生理活性具有重要的作用[24-25]，而喷钙处理的果实，对水溶性钙、 果胶钙含量的提高最为明显，说明喷钙有助于提高细胞活性钙含量。

4　结论

1)肥城桃果实中钙含量与果实的发育进程密切相关，会随着果实各部位的生长而迅速下降。果实中不同的钙组分可能随果实的发育发生了相互转化。

2)喷施钙肥能提高果实总钙含量，水溶性钙、 果胶钙等活性钙含量也有所提高，使得细胞壁钙的分布增多，细胞内钙的分布更均匀，有利于缓解果实发育过程中钙含量的下降。

3)喷施氨基酸钙更有利于果实风味品质的提高。喷施不同形态的钙都能增加肥城桃果肉的不溶性果胶含量，提高果实硬度。

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Effect of foliar Ca spraying on calcium dynamics, fractions and subcelluar distribution of pulp cells of Feicheng peach

WANG Lei, LI Ling, CHEN Xiu-de, HAN Xiao-hu, WANG Yu-xin, GAO Dong-sheng*

(1StateKeyLaboratoryofCropBiology,CollegeofHorticultureScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an,Shandong271018,China)

【Objectives】 Feicheng peach has been always suffered from problems such as browning and poor storability. Calcium fertilization is an effective measure to deal with these problems. Understanding the absorption and distribution of calcium in cells will provide a theoretical basis for calcium fertilization.【Methods】 A field experiment was conducted with 11 year-old Feicheng peach trees as materials in Feicheng City, Shandong Province. 0.5% amino acid-Ca and 0.5% Ca(NO3)2were used as Ca fertilizers, and foliar spraying was carried out every 30 days since one month after the florescence, and water was sprayed in the same way in control. The skin, flesh, stone and seed samples were collected every 30 days since 37 days after florescence. The contents of different calcium fractions were measured. The Ca subcelluar distribution in pulp cells was observed using electrical microscope. 【Results】 The highest calcium content was in young fruit stage. The total calcium contents, water soluble calcium contents and pectate calcium contents showed downward trends with the maturity of the fruits. Spraying calcium increased the total calcium contents in the skin, flesh, stone and seeds, with the most significant increase in flesh. At the fruit mature period, the total Ca contents of flesh treated with amino acid-Ca and Ca (NO3)2were increased by 68% and 77%. Observed with the electron microscope, the Ca treated pulp cells showed uniform calcium distribution on the cell wall, cell membrane and vacuole membrane; calcium was accumulated in the vacuole. The pulp cells without calcium treatment showed decreases of the calcium contents in cell wall, and calcium uniform distribution in cell membrane and vacuole membrane. The browning pulp cells showed the rare and uneven calcium distribution. 【Conclusions】 The total calcium contents decreased rapidly with the growth of Feicheng peach. Spraying calcium increased the contents of activated calcium and calcium distribution in the cell walls, so it was beneficial to remit the decrease of calcium content in the fruit development. Spraying different forms of calcium increased insoluble pectin contents of flesh and increased the firmness of fruits.

Ca foliar spraying; Feicheng peach; calcium dynamics; calcium fraction;subcellular distribution of calcium

2015-02-02接受日期: 2015-08-23网络出版日期: 2016-05-05基金项目: “肥城桃”提质增效工程研究； 山东省现代农业产业技术体系水果产业创新团队—栽培与设施装备项目(SDAIT-03-022-05)资助。

王雷(1989—)， 男， 山东滨州人， 硕士研究生， 主要从事果树生理方面的研究。 E-mail: wllhaha@126.com

E-mail: dsgao@sdau.edu.cn

S143.7+2

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1008-505X(2016)04-1102-09