云南西部地区居民区小型兽类携带病原体检测

杜春红，尹家祥，左曙青，栗冬梅，王秀芳，程晓藕，刘正祥，杨光璨



云南西部地区居民区小型兽类携带病原体检测

杜春红1，尹家祥2，左曙青3，栗冬梅4，王秀芳2，程晓藕2，刘正祥1，杨光璨1

目的了解云南西部地区居民区小型兽类携带病原体情况，为自然疫源性疾病的防治提供科学依据。方法在滇西地区8个州(市)中抽取的10个县(市、区)40个自然村中，随机抽取800户家庭(每村20户)，进行室内捕鼠，采集鼠脾脏标本并提取基因组DNA，鼠肺标本提取RNA，运用聚合酶链反应(PCR)或免疫学方法，检测鼠疫、巴尔通体、伯氏疏螺旋体、巴贝西原虫、人粒细胞无形体、埃立克体、汉坦病毒等病原体。结果捕获9种421只小型兽类，采集脏器样本404份，血清样本325份。检出鼠疫F1抗体两种方法共同阳性血清1份；扩增到巴尔通体枸橼酸合酶(gltA)基因64份，阳性率为15.84%，基因分析表明属6种基因型；检出伯氏疏螺旋体5S～23SrRNA间隔区基因5份，阳性率为1.24%，系统发育树显示均为Borreliaafzelii型；检出1例复合感染。其余病原体检测均为阴性。结论滇西地区室内小型兽类感染病原体种类多，分布广，对人类健康有一定的危害，需加强监测并采取预防控制措施。

滇西地区；居民区；小型兽类；病原体

serum specimen was positive for plague F1 antibody. Sixty-fourgltAgene ofBartonellawas amplified by PCR and the positive rate was 15.84% (64/404). Gene analysis showed that 6 gene types forBartonellainfection were found. The 5S-23SrRNAgene ofBorreliaburgdorferiwas amplified by PCR and the positive rate was 1.24% (5/404). Phylogenetic tree showed that they wereBorreliaafzeliigene type. One small mammal tended to complex infection. Others were negative. In households of Western Yunnan Province, different types of pathogen infections exist in small mammals and there are potential hazard for human. Diseases surveillance should be strengthened and measures of control and prevention need to be implemented.

Supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81060229, 81360413, 81460485), the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry (No. 〔2011〕1568), the Yunnan Provincial Training Special Funds for High-level Health Technical Personnel (No. D-201249), the Yunnan Provincial Training of Youth Leader in Academic and Technical Reserve Talents (Nos. 2013HB080, 2014HB093), and the Dali University Doctoral Scientific Research Foundation (No. KYBS201302)

小型兽类为小型哺乳动物的统称，泛指啮齿目(Rodentia)、食虫目(Insectivora)、攀鼩目(Scandentia)、兔形目(Lagomorpha)、翼手目(Chiroptera)以及食肉目(Carnivora)中的部分小型动物。由于它们种类繁多、分布广泛、迁移性小、适应性强，构成了生态系统的重要组成部分。部分种类对人们的日常生活、农田水利、林业、牧业等造成危害，有些小兽(尤其是啮齿动物)及其体表寄生虫还与人类疾病相关，在病原体的长期保存、疾病传播和流行中具有重要意义[1-2]。云南省地处中国西南边陲，动植物资源异常丰富，尤其是滇西地区地理环境和气候条件复杂多样，从而孕育了自然疫源性疾病宿主动物和媒介生物多样性的特征。既往疫情发生和调查结果显示，该区域是云南省多种自然疫源性疾病如鼠疫、肾综合征出血热、钩端螺旋体病、巴尔通体等的高发地区[3-5]。而农村居民区多与耕地、林地接壤或交汇，室内常有小型兽类分布，并与人类密切接触，其携带病原体易于传播给人类。因此有必要了解该区域小型兽类病原体携带状况，为疾病预防控制提供科学依据。

本研究对滇西10县、市20个自然村居民区室内小型兽类感染鼠疫、巴尔通体、伯氏疏螺旋体、巴贝西原虫、人粒细胞无形体、埃立克体、汉坦病毒等病原体的情况进行调查研究。

1　材料和方法

1.1标本采集在滇西地区的8个州(市)抽取德钦、玉龙、兰坪、永仁、祥云、南华、耿马、云县、芒市、隆阳区10个县(市、区)，每个县(市、区)选择4个自然村，对每个自然村的全部住户进行编号，根据编号随机抽取20户家庭，共计800个家庭进行调查。详细抽样信息见表1，采样区分布见图1。以笼夜法进行捕鼠，每户放置5个鼠笼，连续放3夜，每天检查。如有捕获则更换新笼继续放置。捕获的动物带回实验室进行种类鉴定，股静脉采集血液分离血清，无菌条件解剖取脏器组织材料。

图1　调查采样区分布Fig.1　Distribution of sampling area

1.2试剂与设备

1.2.1鼠疫免疫学检测分别采用3种方法检测鼠疫菌F1抗体和F1抗原。双抗原和双抗体夹心ELISA诊断试剂盒(ELISA法)由兰州生物制品研究所有限责任公司提供，试剂盒批号20120101、20111202；间接血球凝集试验试剂盒(IHA、RIHA法)由吉林博德医学免疫制品有限公司生产，试剂盒批号20130101、20130101；胶体金免疫层析(GICA法)试纸条由云南省地方病防治所自制，批号：201301、201201。

1.2.2分子生物学检测血液组织DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)，组织RNA提取试剂(Trizol. Ambion)，2×Taq MasterMix(TakaRa)，100 bp ladder Marker(Biomed)，引物由北京天一辉远生物技术有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3仪器设备高通量组织研磨仪(德国Retsch，MM400型)、水平电泳槽 JY-SPFT型、PCR仪(德国SENSO，LabCycler Gradient Fuses型)，凝胶成像分析仪(美国Syngene，G:Box)。酶标检测仪Anthos 2010型，自动洗板机BIO-RAD 1575型。

表1样本抽取资料

Tab.1Sample selection data

州(市)Prefecture(City)县(市、区)County(City)乡(镇)Township(Town)自然村Village家庭(户)Family(Household)大理州祥云县普淜镇必乍村、董家村80下庄镇老张五村、小刘营迪庆州德钦县佛山乡江坡村、溜筒江村80云岭乡斯农布村、西当村丽江市玉龙县太安镇吉子村、汝南村80黄山镇金龙村、鹿子村楚雄州永仁县维的乡恩旧村、桃苴大村80永定镇拉务么村、太平地大村南华县沙桥镇新建村、朱家屯村80雨露乡果乐村、金家村保山市隆阳区辛街乡北村三组、柳树坝村80板桥镇马家二组、赵家湾村德宏州芒 市芒市镇芒晃村、偏窝村80遮放镇街道三社、非海二社临沧市云 县漫湾镇昔宜组、大温竹村80晓街乡老普组、新寨村耿马县贺派乡芒嘎弄组、芒广组80勐撒镇半坡村、上细卡组怒江州兰坪县河西乡大羊村、共兴村80通甸镇罗古箐村、清甸湾村Total102040800

1.3方法

1.3.1鼠疫免疫学检测采用3种方法分别对血清作鼠疫F1抗体、脏器悬液上清作F1抗原检测，试验方法严格按试剂盒说明书操作，标本处理参照《鼠疫防控应急手册》[6]。ELISA初筛阳性者作验证试验，即用含F1抗原或抗体的稀释液与用样本稀释液同时对平行检测样本，前者为验证列，后者为滴度列。当验证列阳性反应孔数比滴度列低2孔或2孔以上为验证试验阳性。被检测孔A450(S)/阴性对照孔A450比值的平均值(N)≥2.1时(阴性孔A450值<0.1者，以0.1计)的最高稀释度作为滴度终点。GICA检测以质控线和检测线均出现紫红色带判定为阳性。IHA和RIHA采用V板法，初筛阳性者作抑制试验，当血凝抑制列呈阳性“++”凝集的孔比血凝试验列少2孔及以上时，可判定为特异性凝集；以出现反应强度“++”的最高稀释度作为滴度终点。同一份样品均用3种方法作平行检测。

1.3.2分子生物学检测取10 mg脾脏组织研磨后，按照试剂盒说明书逐步提取DNA。肺脏组织研磨后，按照试剂盒说明书逐步提取RNA。RNA采用M-MLV酶(美国，Promega)和引物P14逆转录为cDNA，分别以DNA和cDNA为模板进行聚合酶联反应(PCR)。检测病原名称、扩增引物及条件等见表2. PCR产物用带有Goldviev的1.5%的琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像仪观察结果。每次实验均设立空白对照，为避免标本污染所造成的假阳性，DNA模板的提取、反应体系的配制、模板的添加、PCR的扩增均在不同的房间进行。

1.3.3序列测定与分析PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司、北京擎科新业生物技术有限公司测序。登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具将测序结果与GenBank中注册基因序列进行同源性比对。采用Lasergene软件包的MegAlign程序进行序列比对。应用MEGA6.06软件，邻接法Neighbor-Joining，Kimura 2-parameter model，bootstrap 1000构建系统发育树。

表2病原体核酸检测所用引物和扩增条件

Tab. 2Sequences of primers and conditions of PCR amplification for pathogen detection

目的病原体Targetpathogens扩增目的基因Targetgenesamplified引物名称Primer核苷酸序列Nucleotidesequence(5'-3')扩增条件(退火温度/时间,延伸温度/时间)Amplificationconditions(Annealingtemperature/time,Extensiontem-perature/time)产物长度ProductLength(bp)伯氏疏螺旋体Borreliaburgdor-feri5S～23SrRNA间隔区基因Spacergene23S3CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC55℃/30s,72℃/30s41223SaTAAGCTGACTAATACTAATTACCC23S6TCCTAGGCATTCACCATA59℃/30s,72℃/30s25223S5CTGCGAGTTCGCGGGAGA巴贝西原虫Babesiosis18srRNAbvif1CAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACA53℃/30s,72℃/30s370bviprCAACCGTTCCTATTAACCATTAPrima-fCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCTAA55℃/30s,72℃/30s150Prima-rCGATAACGCAGAAATTCAACTACGAG巴尔通体BartonellagltABhCS781.pGGGGACCAGCTCATGGTGG50℃/30s,72℃/1min379BhCS1137.nAATGCAAAAAGAACAGTAAACA新发立克次体(外引物)NewRickett-sia(Outerprimer)16SrRNAEh-out1TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG55℃/30s,72℃/1min653Eh-out2CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC埃立克体(内引物)Ehrlichia(Innerprimer)HME1CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT55℃/30s,72℃/1min389HME2TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTATHGA1GTCGAACGGATTATTCTTATAGCTTG55℃/30s,72℃/1min389HGA2TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAC人粒细胞无形体(内引物)HumanGranulocyticAnaplasmosis(In-nerprimer)传统立克次体(外引物)TraditionalRickettsia(outerprimer)groELGro-1AAGAAGGAGTGATAAC45℃/40s,72℃/40s649Gro-2ACTTCAGTAGCACC斑点热、斑疹伤寒(内引物)Spottedfever,Typhus(In-nerprimer)SF1GATAGAAGAAAAGCAATGATG56℃/35s,72℃/35S217SR2CAGCTATTTGAGATTTAATTTGTF1ATATATCACAGTACTTTGCAAC56℃/35s,72℃/35S364TR2GTTCCTAACTTAGATGTATCAT恙虫病东方体(内引物)Orientiatsut-sugamushi(Innerprimer)汉坦病毒hantavirus逆转录引物Rt-pcrprimer外引物Outerprimer内引物InterprimerP14HTN-LF1HTN-LR1HTN-LF2HTN-LR2TAGTAGTAGACTCCATGTAYGTBAGTGCWGATGCAACCADTCWGTYCCRTCATCTGCWGATGCHACIAARTGGTCGCRTCRTCWGARTGRTGDGCAA55℃/30s,72℃/30S55℃/30s,72℃/30S450378

2　结　果

2.1小型兽类的组成与分布本次调查共捕获小型兽类421只，分属于2目2科6属9种，采集有效脏器标本404份，其中黄胸鼠269份(66.58%)，小家鼠75份(18.56%)，褐家鼠23份(5.69%)，大足鼠23份(5.69%)，臭鼩鼱7份，齐氏姬鼠2份，短尾鼩2份，灰麝鼩2份，卡氏小鼠1份。见表3.因部分捕获动物解剖前死亡，采集有效血清标本325份，其中黄胸鼠221份(68.0%)，小家鼠60份(18.46%)，褐家鼠18份(5.54%)，大足鼠19份(5.85%)，臭鼩鼱3份，齐氏姬鼠1份，灰麝鼩2份，卡氏小鼠1份。

表3脏器材料组成与分布情况

Tab. 3The composition and distribution of viscera materials

采样点SamplingSites黄胸鼠Rattustanezumi褐家鼠Rattusnorvegicus小家鼠Musmusculus大足鼠Rattusnitidus臭鼩鼱Suncusmurinus齐氏姬鼠Apodemuschevrieri短尾鼩Anourosorexsquamipes灰麝鼩Crociduraattenuata卡氏小鼠Muscaroli合计Total德钦———16—————16玉龙162———————20兰坪174—1—————22永仁42726————185祥云1715———————33南华36————————36隆阳区23—————22—27芒市94————————100云县37————————39耿马25————————26合计26923752372221404

2.2鼠疫免疫学检测结果404份鼠脏器经研磨后，取上清进行鼠疫F1抗原检测，3种方法检测结果均为阴性。325份血清样本采用3种方法检测鼠疫F1抗体，结果为：IHA均为阴性，GICA阳性6份，阳性样本来自芒市镇(1)、永仁县(3)、隆阳区(1)和南华县(1)，宿主动物为小家鼠(3)、黄胸鼠(3)。ELISA阳性3份，均来自芒市镇，宿主动物为黄胸鼠(2)、臭鼩鼱(1)。其中芒市镇一份黄胸鼠血清样本GICA和ELISA两种方法同时阳性，抗体滴度为1∶320。

M:DNA相对分子质量标准；PC:阳性对照；NC：空白对照图2　gltA基因片段的凝胶电泳图Fig.2　Gel electrophoresis image of amplified gltA partial sequence

2.3巴尔通体枸橼酸合酶(gltA)基因检测结果共检测出巴尔通体gltA基因阳性65份，见图2。经测序分析，64份为巴尔通体序列，阳性率为15.84%，仅黄胸鼠和褐家鼠检出阳性，黄胸鼠阳性率最高(62/269，23.05%)，褐家鼠仅检出2份(8.70%，2/23)。经卡方检验分析，2种鼠的阳性率无显著性差异(χ2=1.781，P=0.1821)。从地域上看，在纬度稍高的德钦、玉龙、兰坪、永仁、祥云、南华等6个县仅检出3份阳性。检出阳性最多的芒市，该地也是鼠密度最高、黄胸鼠密度最高的地区。基于gltA基因的262 bp序列进行系统发育分析，结果显示滇西地区至少存在6种基因型的巴尔通体。绝大多数毒株与B.tribocorum同源关系最近(A)，主要分布在芒市、云县、耿马、隆阳区；11个毒株与B.queenslandensis拥有共同的进化祖先，可能属于B.queenslandensis型(B)，主要分布在耿马、芒市、云县、玉龙；2株(260和278)与B.elizabethae同源关系最近(C)，2个毒株(331和304)与B.rochalimae拥有共同的进化祖先，属于B.rochalimae型，另外还有2个可能的新型D、E。芒市毒株基因型较为复杂，6种均存在，以A群为主，2个可能的新型也分布于该地。详见图3。

图3　基于巴尔通体基因gltA基因部分测序结果构建的进化树Fig.3　Phylogenetic analysis based on partial gltA gene of Bartonella

2.4伯氏疏螺旋体5S～23SrRNA间隔区基因片段检测结果404份脾脏提取DNA经巢式PCR扩增，5份样品扩增到目的片段，阳性率为1.24%。PCR产物电泳结果见图2。5份阳性样本分别来自祥云(3)、云县(1)、兰坪(1)，检出小兽有黄胸鼠(3)、褐家鼠(1)、臭鼩鼱(1)。其中2份阳性样本成功测序，测序结果与GenBank中注册的核苷酸序列进行比较，检出的伯氏疏螺旋体构建的系统发育树显示均与Borreliaafzelii型同源性最高，但来自祥云的XiangYun29和来自兰坪的LanPing420之间有一定差距(见图4)。

M: DNA相对分子质量标准；PC:阳性对照；NC：空白对照图4　5S～23S rRNA基因间隔区PCR扩增结果Fig.4　PCR amplification of the 5S-23S rRNA gene spacer region

2.5其他检测结果对404份小兽脾脏提取的DNA样本，采用巢式PCR方法分别扩增巴贝西原虫18srRNA，立克次体采用属特异及种特异分型引物扩增16srRNA和热休克蛋白基因groEL，结果均未扩增到目的片段。对183份小兽肺脏标本提取的RNA，采用逆转录聚合酶链反应(ReverseT ranscr iptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测汉坦病毒核酸，结果均为阴性。

2.6复合感染情况上述多种病原的检测，检出1例伯氏疏螺旋体和巴尔通体复合感染，样本来自祥云县的一只褐家鼠。

3　讨　论

云南省是自然疫源性疾病流行最为严重的省份之一，滇西地区由于特殊的地域特征和气候条件，哺乳动物非常丰富。据调查统计，此区域已知小兽就达到5目11科58属187种(亚种)[4]。而小兽是多种自然疫源性疾病的重要传染源，也是病原体和媒介昆虫的主要宿主。从而构成了该地区自然疫源性疾病种类多、疫情严重而复杂的形势[3,5]：云南鼠疫历史悠久，疫源地广泛[7]，自1982年疫情复燃以来，鼠疫监测县及人间病例数为全国之冠。肾综合征出血热近几年发病县(市)不断增多，疫源地范围不断扩大[8-9]。巴尔通体呈高度流行态势，并具有宿主多样性及基因型别多样性特征[10]。分子生物学、免疫学检测证实存在人粒细胞无形体、埃立克体、巴贝西原虫、伯氏疏螺旋体等病原体[11-16]。

图5　5S～23S rRNA间隔区进化树分析Fig.5　Phylogenetic analysis of the 5S-23S rRNA spacer regions

鼠疫是烈性传染病，云南省存在家、野鼠鼠疫疫源地，宿主动物的监测是防治工作的重要内容。本调查对捕获的小兽脏器和血清标本进行了鼠疫F1抗原和F1抗体检测，结果F1抗原均阴性，检出F1抗体阳性血清。其中1份来自芒市镇的黄胸鼠血清GICA和ELISA两种方法均阳性，抗体滴度达1∶320，IHA阴性。可能与前2种方法敏感性高有关[17]。该地是家鼠鼠疫疫源地，曾多次发生鼠间和人间鼠疫疫情，本次调查结果F1抗原检测均阴性，表明暂无动物间疫情发生。但该地具备了动物间鼠疫流行前期的宿主动物、媒介存在的3项预兆指标[18]，加之主要宿主动物黄胸鼠抗体低滴度阳性血清的检出，需引起高度重视。虽然近年我省鼠疫疫情处于相对静息状态，但近期多地宿主、媒介等调查指标表明[19]有再度暴发的可能性。巴尔通体(Bartonellaspecies)是一种可通过吸血节肢动物在脊椎动物间传播的病原微生物，人类可能因与携带病原体的动物接触而感染或致病，引起的疾病谱较为广泛。本次调查从6县市检出64份阳性，阳性率为15.84%。黄胸鼠和褐家鼠检出阳性，阳性率分别为23.05%(62/269)和8.70%(2/23)。阳性样品经测序后作同源性比对，构建系统发育树。结果发现他们变异度较大，至少可以分为6种基因型，除了B.tribocorum、B.elizabethae、B.queenslandensis、B.rochalimae外还有2个可能的新型。因此这些地区人群受巴尔通体感染的风险较高。莱姆病(Lyme disease, LD)是一种由伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)感染、经携带病原体的蜱叮咬传播的自然疫源性疾病。宿主动物较多，包括鼠、兔、鸟等野生脊椎动物及犬、马、牛等家畜，鼠类是重要的宿主动物之一。本调查共从3个县的3种小兽中检出5份阳性样本，其中两份测序结果分析，均属于b.afzelii基因型，但其变异度较大。该区域宿主动物感染的伯氏疏螺旋体、巴尔通体均存在基因多样性的特点，这些基因型多与人类致病性有关，并检出1例巴尔通体和伯氏疏螺旋体复合感染的褐家鼠。立克次体、巴贝西原虫、汉坦病毒检测均为阴性，可能与采样点均在居民区、小兽种类偏少、几乎不携带媒介昆虫蜱有关。尤其是肾综合征出血热，褐家鼠是家鼠型出血热的主要传染源，既往调查祥云县居民区褐家鼠、黄胸鼠阳性率达6.25%、10.00%，但本次未检出阳性可能样本采集后未放液氮，低温保存时间过长RNA发生降解，今后需多加注意。

小型兽类尤其是啮齿动物是多种自然疫源性疾病的宿主动物和媒介宿主，其分布广泛，居民区活动的鼠类及其携带的病原体对人类健康带来的危害更大。本研究检测结果显示滇西居民区小兽携带病原体种类多，并有两种病原体复合感染的情况，部分地区鼠密度、蚤指数偏高，需引起重视。同时，滇西地区是重要的鼠疫疫源地，在鼠疫防治工作中，疾病监测和各级部门投入人力财力开展的鼠疫防治联防工作，不仅能有效预防烈性传染病鼠疫，对多种自然疫源性疾病的防治、减少鼠害造成的经济损失同样具有重要意义，值得进一步推广应用。

(致谢：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所郝琴团队给予莱姆病检测指导，云南省地方病防治所钟佑宏、石丽媛、苏丽琼等同志参与了部分现场资料收集工作，以及参与此项工作的10县(市、区)疾病预防控制中心和乡镇卫生院的同志及配合调查的所有个人和家庭。)

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Pathogen infection of small mammals from households in Western Yunnan Province

DU Chun-hong1, YIN Jia-xiang2, ZUO Shu-qing3, LI Dong-mei4,WANG Xiu-fang2, CHENG Xiao-ou2, LIU Zheng-xiang1, YANG Guang-can1

(1.YunnanInstituteforEndemicDiseasesControlandPrevention,Dali671000,China;2.SchoolofPublicHealth,DaliUniversity,Dali671000,China;3.BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,theStateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,Beijing100071,China;4.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

The situation of pathogen infection for small mammals from households in Western Yunnan Province was investigated to provide scientific basis for natural focal diseases control and prevention. Small mammals were captured in 800 households of 40 natural villages, 10 counties, 8 prefectures, in Western of Yunnan Province. DNA or RNA of specimen from small mammals were extracted and detected plague,Bartonella,Borreliaburgdorferi, BABEI West protozoa,Anaplasmaphagocytophilum,Ehrlichia, and Hantavirus with renal syndrome using PCR or other methods. Results showed that a total of 421 small mammals, belongs to 9 species, was captured. Of 404 viscera specimens and 325 serum specimens were collected, one

Western Yunnan Province; household; small mammal; pathogen infection

Yin Jia-xiang，Email: chinayjx@hotmail.com

尹家祥，Email: chinayjx@hotmail.com

1.云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，大理671000；2.大理大学公共卫生学院，大理671000；3.军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071；4.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京102206

R378

A

1002-2694(2016)07-0623-09

2016-04-21；

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.007

国家自然科学基金项目(No.81060229, 81360413, 81460485)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留〔2011〕1568号)；云南省高层次卫生技术人才培养专项(D-201249)；云南省中青年学术和技术带头人后备人才、技术创新人才培养项目(No.2013HB080，2014HB093)和大理学院博士科研启动费项目(KYBS201302)