北运河沉积物中主要脱氮功能微生物的群落特征

鲍林林,王晓燕,陈永娟,张苓荣



北运河沉积物中主要脱氮功能微生物的群落特征

鲍林林1,2,3,王晓燕1,4*,陈永娟1,张苓荣1

(1.首都师范大学资源环境与旅游学院,北京 100048；2.中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室,北京 100085；3.中国科学院大学,北京 100049；4.首都师范大学首都圈水环境研究中心,北京 100048)

应用分子生物学技术研究北运河沉积物中主要脱氮功能微生物,反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌(Anammox)的群落特征,探讨了微生物群落的季节变化及其与环境因子的响应关系.结果表明,沉积物中反硝化细菌和Anammox的丰度和群落组成随季节变化差异显著.从夏季到冬季,反硝化细菌丰度逐渐增加,Anammox的丰度却逐渐降低;反硝化细菌的多样性均显著的高于Anammox的多样性,反硝化细菌是北运河沉积物中主要的脱氮微生物.从夏季到冬季,沉积物中氮和TOC含量均逐渐升高,温度是决定脱氮微生物群落特征季节变化的关键因子,TN与反硝化细菌的群落丰度显著正相关,C/N与Anammox的丰度显著正相关;反硝化细菌的群落结构主要受到硝氮和pH的影响,pH也是影响Anammox物种时空分布的主要因子.系统发育分析表明,两种脱氮微生物的主要类群均具有,反硝化细菌主要从属于和, Anammox物种发育多样性较低,主要为浮霉菌门的.

北运河沉积物；反硝化细菌；厌氧氨氧化细菌；季节变化；环境因子；系统发育

人为活动的日益增强已经明显加速了氮的循环,过量氮素进入生态系统容易引发一系列全球性环境问题.对水生态系统来说,氮素造成的水体富营养化问题以及氮循环微生物对氮素的迁移转化作用越来越受到人们关注.氮循环中反硝化作用和厌氧氨氧化作用是去除环境中过量氮素的两个主要过程,分别由反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌(anaerobic ammonia oxidation bacteria, Anammox)所驱动[2-3].反硝化细菌一直是环境中脱氮的主要微生物,而越来越多的研究发现,Anammox广泛的存在于海洋、土壤和湖泊等生态系统中,也具有比较可观的脱氮贡献[4].这2种脱氮微生物在环境中的群落特征和生态功能对全球氮循环的平衡具有重要作用.

,反硝化细菌基因和Anammox的16S rRNA基因或肼氧化还原酶(hydrazine oxidoreductase,)基因常被作为两种微生物的分子标记,以研究其在环境中的群落特征和生态功能[2,5].环境温度、污染物质浓度和溶氧等[6]都是影响这两种脱氮微生物群落结构和生态功能的重要因子.已有的研究主要探讨了河流沉积物中反硝化细菌和Anammox的活性特征[2,7-8]和脱氮效率[3-4,9],而河流生态系统中两种脱氮微生物群落特征的综合对比分析,潜在的生态功能差异和脱氮贡献,及其与环境因子的响应关系还需要深入的研究.

城市河流受人类生产生活干扰剧烈,是氮污染最为突出的区域[10],其水体流速缓慢,污染物质富集于淤积的沉积物中,极易造成二次污染.所以,沉积物中脱氮微生物的群落特征和生态功能直接关系到河流生态系统污染氮素的有效转化和去除.北运河是典型的城市河流,是北京市主要的排污泄洪河道,水体氨氮严重超标,河床沉积物中也储存了大量氮素[11].通过研究北运河沉积物中反硝化细菌和Anammox的群落结构及其季节变化特征,分析微生物群落与环境因子的响应关系,以探讨两种脱氮微生物在城市河流沉积物中的潜在作用和功能差异,为河流生态系统氮素的去除及污染控制提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集和理化分析

沿北运河京区流域范围内水系干流上选择4个采样点,如图1所示,包括马坊桥(1)、坝河口(2)、榆林庄桥(3,凉水河口)和杨洼闸下游(4).分别于2013年7月(夏季)、10月(秋季)和2014年2月(冬季),采集河流表层沉积物(3~5cm).利用便携式柱状采泥器,每个样点断面随机多点抓取河床沉积物,并取其表层部分均匀混合为1个样品,样品用无菌袋封装并4℃冷藏运输.分子实验使用样品﹣20℃冻存,其余样品用作理化参数测定.沉积物的pH值、氨氮(NH4+-N)、亚硝氮(NO-N)和硝态氮(NO3−-N),以及总氮(TN)和总有机碳(TOC)的测定方法参考文献[12].

1.2 微生物PCR扩增和多态性分析

采用Power Soil DNA试剂盒(MO BIO Laboratories Inc.,美国)提取沉积物(0.3g湿样)总DNA,即PCR扩增的模板DNA.反硝化细菌的PCR扩增引物为针对亚硝酸盐还原酶基因()的和nirS 6R,并根据降落PCR的方法进行基因扩增[13-14].Anammox采用巢式PCR,先由引物Pla46f和630r对浮霉菌属进行扩增,再将所得产物作为模板,由特异性引物和Amx820r进行Anammox的16S rRNA基因的扩增[7,15].PCR扩增引物序列及相应温度程序如表1所示.用于T-RFLP分析的PCR产物,对前引物(nirS 1F和Amx368f)的5’端进行(FAM)标记,采用限制性内切酶TakaraⅠ(,大连)酶切以进行群落多态性分析[12].

表1 PCR扩增引物序列及相应的温度程序Table 1 Primers and procedures for PCR amplification

1.3微生物的定量和克隆序列分析

反硝化细菌的定量分析仍以基因为标记,而Anammox定量分析以的拷贝数表示,所用引物为hzocl1F1(TGYAAGACYTGYCAY- TGG)和hzocl1R2(ACTCCAGATRTGCTGAC- C)[16].采用SYBR Green法,对和基因进行绝对定量分析(实时荧光定量PCR,RT-qPCR),定量结果为3次测试的平均值.

通过蓝白斑筛选微生物的阳性克隆子,并将测试序列提交至NCBI数据库,获取序列登陆号(反硝化细菌:KJ777836-KJ778008和KM406982- KM406998;Anammox:KM008745-KM008972).利用DOTUR软件对反硝化细菌和Anammox进行独立操作单元(operational taxonomic unit, OTU)的划分,并建立相应的克隆文库,以邻位相接法(neighbor-joining)构建包括北运河沉积物的检测序列和已发表参比序列的系统发育树.

1.4 数据分析

采用SPSS16.0、OriginPro8.1等软件对数据进行处理.整理后的T-RFLP片段种类数据由PRIMER5.0软件进行微生物群落的香农多样性(Shannon-Weiner,)分析.使用Canoco for Windows 4.5软件,对微生物群落的时空分布及其与沉积物环境因子的响应关系进行典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA).

2 结果与分析

2.1沉积物理化参数

表2 表层沉积物的理化性质Table 2 Physical and chemical properties of sediments

注:S, Summer,夏季; F, Fall,秋季; W, Winter,冬季; NO−,为NO2−+NO3−;C/N为TOC与TN的比值,下同.

各季节沉积物的主要理化参数如表2所示.此外,夏季、秋季和冬季的沉积物上覆水的平均温度()分别为28,12,2℃,北运河沉积物pH值范围6.78~7.77.虽然北运河水体以NH4+污染为主,但在沉积物中,除了夏季3号样点(S3)和冬季1号样点(W1)外,其余各样点的硝氮(NO−,NO-N与NO3−-N的总量)的含量均明显高于NH4+.总体看来,夏季到冬季沉积物中各类污染物质含量逐渐增加,可能与其污水处理厂退水和再生水补给为主[11]有关,秋冬季降雨补给减少,污染稀释作用降低.位于杨洼闸下游4号点的沉积物(S4、F4和W4)中,TOC和TN的含量均相对低于其他样点.此外,TOC和TN的含量存在显著的正相关关系(< 0.05).

2.2 群落丰度的季节变化

如图2所示,基因的拷贝数夏季最低(1.39×107~9.32×107copies/g),秋季次之(1.79× 1010~1.3×1011copies/g),冬季最高(5.9×1010~ 3.34× 1011copies/g);而基因的拷贝数夏季最高(1.03×107~9.37×107copies/g),秋季次之(1.01× 104~1.09×104copies/g),冬季最低(0~1.00× 104copies/g).综合看来,夏季沉积物中反硝化细菌和Anammox的群落丰度相当,而秋、冬季时反硝化细菌群落丰度明显高于Anammox.

由表3可见,不同季节中,各理化参数对微生物群落丰度的影响作用不同.夏季,沉积物TOC含量、C/N与反硝化细菌、Anammox的丰度均具有显著正相关关系,Anammox的群落丰度还与沉积物TN含量相关;秋季,各形态氮素含量和pH值均对反硝化细菌的丰度具有显著影响,而与Anammox的丰度没有显著相关性;冬季,仅pH值与反硝化细菌的丰度显著负相关,Anammox的丰度与TOC、TN含量显著正相关.综合看来,是2种脱氮微生物的群落丰度季节变化的关键因子,反硝化细菌和Anammox的群落丰度分别与TN含量和C/N的变化相关性较高.

表3 群落丰度与环境因子的Pearson相关性Table 3 Pearson’s correlations between microbial abundance and environment factors

注: *<0.05, **<0.01; ns,无显著性.

2.3 群落组成的多样性

表4为北运河沉积物反硝化细菌基因和Anammox基因的T-RFLP片段数目,及其群落多样性指数.一个T-RF片段至少代表一种相应的微生物,群落结构可由T-RFs的组成表征.各样点检测出反硝化细菌的T-RFs 12~20种,Anammox的T-RFs 1~12种,反硝化细菌的群落多样性显著高于Anammox的多样性.秋季,反硝化细菌的T-RFs数量最多,多样性指数最低,但是夏季其T-RFs最少时多样性指数最高.秋季和冬季沉积物中Anammox的群落多样性均高于夏季的群落,其中S3和S4样品的Anammox主要检测出一种T-RF,多样性最低.Pearson相关分析表明,仅冬季的Anammox群落多样性与沉积物NO−存在显著相关性(= 0.99,< 0.05).

图3为物种与环境因子的CCA双轴图,反映了脱氮微生物群落主要T-RFs种类(相对丰度大于6%)的时空分布特征,及其与沉积物主要环境因子的响应关系.如图所示,反硝化细菌和Anammox的主要物种分布均具有显著的季节分异,冬、夏两季的物种组成差异最大,而且夏季各沉积物样点之间的微生物群落结构差异也比较大.

表4 脱氮微生物功能基因的T-RFs和多样性Table 4 T-RF fragments and diversity ofnirSand 16S rRNA genes

2.4 群落结构特征和因子响应

反硝化细菌CCA前四个排序轴的总解释度为86.3%,AX1和AX2对物种—环境因子相关性的解释度分别为37.8%和19%,影响群落时空分布的主要因子有与AX1相关度较高的pH(-0.72)和与AX2相关的(-0.75)和NO−(0.66);Anammox的CCA前四个排序轴的总解释度为88.5%,AX1和AX2对物种—环境因子相关性的解释度分别为35.5%和28%,(0.86)与AX1存在较高的相关性,而pH(0.63)与AX2相关.总体看来, pH值和是影响反硝化细菌和Anammox群落物种时空分布的主要环境因子.

2.5 系统发育特征

对夏季各沉积物中反硝化细菌(0.05的分异度)和Anammox(0.02的分异度)进行了克隆文库的系统发育分析.图4所示为反硝化细菌的系统发育树,根据其系统发育关系,主要划分为两支.Cluster A包含了43%的克隆序列,其发育多样性高于Cluster B,主要与各种沉积物环境来源的序列相似性较高.Cluster A又可分为两个亚支,大部分的序列属于Cluster A1,而Cluster A2主要包含1号样点的克隆序列,其与发现于碱性咸水湖泊的sp. HGD1[17]同源性较高.Cluster B主要由2、3号样点的序列组成,与活性污泥和反应器环境中的类群同源性较高,而且2号样点的所有序列属于这个分支.此外,2号样点的序列2d20及同一OUT的其他27个克隆序列与水稻根系土壤中检测出的RCH2的相应片段具有83%的相似性,而序列2d16与58Eu具有91%的相似性[18].

Anammox的系统发育树也主要划分为两支(图5),Cluster A包含了65.9%的测试序列,主要与土壤、沉积物以及活性污泥等环境来源的类群同源性较高,而Cluster B与土壤和地下水等环境来源物种的相似性很高.Cluster A和Cluster B均与长江河口潮间带沉积物中的属的序列[19]具有较高的同源性,可见,是北运河沉积物中主要的Anammox类群.

3 讨论

3.1 脱氮微生物群落特征的季节变化

对北运河夏季、秋季和冬季沉积物中脱氮微生物群落特征的研究表明,反硝化细菌的群落丰度明显高于Anammox.反硝化细菌一直是环境中主要的脱氮类群,而且群落丰度与脱氮微生物的活性具有正相关性[2,9],由此看来,具有显著丰度优势的反硝化细菌也是北运河沉积物中的主导脱氮微生物.长江河口湿地[19]和美国New River河口,其沉积物中主要的脱氮贡献者也均为反硝化细菌.此外,微生物群落丰度存在显著的季节变化,夏季到冬季反硝化细菌的丰度逐渐增加,Anammox的丰度却显著降低.已有研究也有类似的结果,辽河口沉积物中反硝化细菌的数量春季最多,秋季次之,夏季最少,且马恩河(法国)秋、冬季沉积物的反硝化活性高于春、夏季的活性[8],均表明干冷季节河流沉积物反硝化细菌群落丰度和相应的功能更具优势.莱州湾,冬季反硝化细菌的群落丰度更高,夏季的Anammox群落丰度高于冬季[5],太湖流域河流沉积物夏季和初秋的Anammox脱氮活性也高于冬季的活性[20],可见,与反硝化细菌相反, Anammox在暖湿季节的群落特征和功能活性更具优势.

群落多样性的结果表明,北运河沉积物中反硝化细菌的群落多样性显著高于Anammox,进一步验证反硝化细菌在脱氮作用中的群落优势.此外,脱氮微生物的群落结构,尤其是Anammox,具有显著的季节分异.已有研究认为,沉积物微生物群落结构的季节分异,与河流季节性的温度和降水变化有关,如湿季(夏季)和干季(秋季)微生物的优势种类组成明显不同[21].

3.2 反硝化细菌和Anammox的物种进化特征

环境中的反硝化细菌主要包括、、和等类群[22],系统发育分析的结果表明,北运河沉积物大部分反硝化细菌的克隆序列(Cluster B)都与同源.孔强等[23]曾在天津段北运河中分离培养了一株好氧反硝化细菌,鉴定其为sp.,而且该类群具有良好的TN和NO3−降解效率.可见,sp.类群是北运河沉积物中的主要反硝化细菌.此外,Cluster B中部分序列还与索氏菌属()相关类群的相似性很高.是广泛存在于各种类型废水处理装置中的功能类群[24],也含有基因片段,具有亚硝酸盐还原功能,与的基因具有很高的相似性[18]. Cluster A主要与的反硝化细菌同源.是一类耐盐性很强的中度嗜盐菌,属于极端微生物,主要分布于高盐含量、污染的或碱性的环境中[25],Berendes等[26]就从城市的污水处理厂中分离出一株参与反硝化作用的sp.,研究表明类群的反硝化细菌也具有显著的脱氮作用[17].在氮污染严重的北运河沉积物中,、和相关类群的反硝化细菌分布广泛,对北运河过量氮素的去除具有重要作用.

浮霉菌门的Anammox主要包括Candidatus Brocadia、Kuenenia、Scalindua和Jettenia属,北运河沉积物中Anammox的主要发育类群从属于Candidatus Brocadia.研究表明, Candidatus Brocadia和Candidatus Jettenia是高氮含量的泥炭土壤中主要的Anammox[27],而且Candidatus Brocadia也是污泥反应器中的主要类群,能够耐受高浓度的NO2−,脱氮效果显著[28].由此看来, Candidatus Brocadia作为北运河沉积物中主要的Anammox类群,显著的耐污、脱氮特征也反映出其对北运河污染环境的适应和一定的脱氮贡献,当然,Anammox的脱氮贡献大小及其与反硝化细菌的共同作用,还需要进一步对脱氮活性进行定量研究.

3.3 主要环境因子的影响作用

微生物的群落特征是与环境变化相互作用的结果.因子分析表明反硝化细菌的群落丰度与NO−、NH4+和TN的含量具有显著正相关关系,其物种的时空分布也与NO−相关.北运河水体流速缓慢,为沉积物反硝化细菌营造了较好缺氧环境,所以,氮素的可利用性是决定脱氮微生物群落结构和功能作用的重要因子.等[29]在太湖流域的研究发现,沉积物反硝化速率随NH4+含量的增加而升高,而且当高含氮污水排入河流时,氮素的去除效率;长江河口沉积物的反硝化细菌数量和反硝化速率也与NH4+浓度呈显著正相关关系[9].相关研究还表明,径流NO浓度升高,水库内沉积物的反硝化活性随之升高[30],可见,氮相关营养盐水平对反硝化细菌的群落分布和功能活性具有重要的影响作用[31-32].

研究表明,Anammox在NH和NO−共存的环境条件下分布更为广泛,氮的可利用性对Anammox的生长也很重要[33].但是,莱州湾河口沉积物的Anammox群落丰度与NO3−含量呈负相关[5],东江沉积物中的研究也发现的丰度与NO2−显著负相关[34],这可能与过高的氮­­­­含量对沉积物Anammox群落生长具有抑制作用有关[35].从本文的研究结果看来,NO−与NH4+的含量从夏季到冬季逐渐升高, Anammox群落丰度也逐渐降低,虽然两者之间并没有显著的相关性,群落丰度的具体响应值得深入探讨.因子分析结果还表明,沉积物C/N的值与Anammox的群落丰度显著正相关,已有研究表明在污水处理系统中,Anammox在高氨氮低C/N(2左右)的条件下才具有较高脱氮效率[36],可见,北运河沉积物C/N含量与Anammox的群落功能可能也存在积极的响应关系,有待进一步论证.

此外,有机质含量对脱氮微生物群落特征也有一定的影响作用,钱塘江沉积物中有机碳是决定沉积物Anammox分布和群落多样性(负相关)的主要因子[37],东湖沉积物有机质的含量与基因拷贝数正相关[38],本文表明夏、秋季的TOC与微生物群落丰度具有显著的响应关系.季节性的温度变化对反硝化细菌和Anammox群落丰度和物种时空分布的影响作用最为显著,综合河流水文化学的季节性变化,脱氮微生物与环境因子的响应更为复杂,所以,要阐明其与脱氮微生物相互作用的具体机制,还需要更深入的全面的探究.

4 结论

从夏季到冬季,北运河沉积物中主要氮含量和TOC逐渐增加,受闸坝上游水体的拦截作用和闸坝下游水体流速激增的扰动影响,4号样点沉积物中的TOC和TN含量相对较低.反硝化细菌的群落丰度从夏季到冬季逐渐增加,Anammox丰度却显著降低;两种微生物的群落结构具有显著的季节差异.反硝化细菌的群落多样性显著高于Anammox的多样性.综合看来,反硝化细菌是北运河沉积物中主要的脱氮微生物.

4.2 季节变化是影响反硝化细菌和Anammox群落丰度和物种组成的关键因子,和C/N分别与反硝化细菌和Anammox的群落丰度显著正相关,反硝化细菌的群落结构主要受到硝氮和pH值的影响,pH值也是决定Anammox群落物种时空分布的主要因子.

4.3 系统发育分析表明,水体氮污染严重的北运河中,沉积物的脱氮微生物类群都具有良好的耐污性和较高的脱氮效率,反硝化细菌主要与沉积物和活性污泥等环境中的类群同源,从属于和;Anammox与土壤、沉积物、活性污泥和地下水等来源的类群相关,主要为浮霉菌门的.

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* 责任作者, 教授, wangxy@cnu.edu.cn

Diversity, abundance and distribution of-type denitrifiers and Anammox bacteria in sediments of Beiyun River

BAO Lin-lin1,2,3, WANG Xiao-yan1,4*, CHEN Yong-juan1, ZHANG Ling-rong1

(1.College of Resources, Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China；2.State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China；4.Research Center of Aquatic Environment in the Capital Region, Capital Normal University, Beijing 100048, China)., 2016,36(5)：1520~1529

Denitrification and anaerobic ammonia oxidation are two main processes for nitrogen removal in nitrogen cycle. The seasonal variation of community diversity and abundance, phylogenetic composition of-type denitrifiers and Anammox (anaerobic ammonia oxidation) bacteria of sediments in Beiyun River were compared based on PCR (polymerase chain reaction), T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism), clone and sequencing. The abundance of-type denitrifiers increased from summer to winter while the abundance of Anammox bacteria decreased significantly. What’s more, the abundance of-type denitrifiers was significantly higher than Anammox in fall and winter. Community composition of the two microbial groups varied seasonally and the community diversity of-type denitrifiers was much higher than Anammox bacteria. Concentrations of nitrogens and organic carbon in the sediments increased significantly from summer to winter. Environmental temperature was significantly correlated with the seasonal changes of abundance and community distribution of the two microbial groups in sediments. Correlation analysis revealed that total nitrogen had a great effect on the abundance of-type denitrifiers, while C/N was significantly correlated with abundance of Anammox bacteria. NO−and pH were also the main environmental factors determining the community distribution of-type denitrifiers and Anammox bacteria in sediments.. Phylogenetic diversity of-type denitrifiers was much higher than that of Anammox bacteria.-type denitrifiers were grouped into generaand, while Anammox was mainly bacteria belonged to.

Beiyun River sediment；-type denitrifiers；Anammox；environmental factors；phylogeny

X172

A

1000-6923(2016)05-1520-10

鲍林林(1990-),女,四川绵阳人,博士研究生,主要从事生态环境治理和流域生态诊断研究.发表论文11篇.

2015-10-08

国家自然科学基金项目(41271495);国家重大水专项(2009ZX07209-001-02)