模拟生物膜上识别食品中铝离子毒性机理的研究

廖天录，廖天江（甘肃工业职业技术学院 化工学院 甘肃天水 741025）



模拟生物膜上识别食品中铝离子毒性机理的研究

廖天录，廖天江（甘肃工业职业技术学院 化工学院 甘肃天水 741025）

以玻碳电极支撑的磷脂双层膜（s-BLM） 作为生物膜的模型，Fe（CN）63-/4-为探针分子， 利用循环伏安法和交流阻抗技术研究了铝离子与s-BLM 的相互作用，结果表明， 铝离子与s- BLM之间可以发生比较强烈的相互作用， 诱发s-BLM 上形成离子通道， 并且作用后的s-BLM 在10mmol/L 的柠檬酸三钠（Sodium citrate）溶液中能够自我修复， 这表明采用强的鳌合剂从机体组织中将铝夺取，撤走铝离子则通道关闭。

铝离子；循环伏安；交流阻抗；离子通道；支撑磷脂双层膜

0、引言

对哺乳动物来说， 铝是一种非必需元素，由于铝制品在医药、食品加工及日常生活中的广泛应用，人体中的铝的含量有逐渐增高的趋势，其与人体健康的关系倍受关注。近年来，有关铝对人类健康作用的研究表明，铝对人的毒性表现为引起神经失调，在Parkinson’s 病和Alzheimer’s 病患者的大脑中发现有铝的积累；一些长期透析治疗肾功能障碍的病人出现神经症状， 称为“透析脑病”，从死于这种疾病的人脑灰质里发现有高浓度的铝。铝毒性分子学机理研究表明，铝的有毒形态是自由态Al3+，如果能够与自由态Al3+形成稳定的配合物的配体即可降低自由态在人体内的浓度，从而降低或解除铝对人体的毒性；Akeson等人近来的研究结果表明Al3+强烈地结合在PC 脂质体的表面，且改变了其膜电位；Martin报告Al3+在膜上的结合位点是磷酸酯或碳酸酯基团， 铝离子引起脂质体膜脂结构的改变有关。

生物膜上离子行为的研究已经引起人们越来越大的兴趣， 20世纪60年代后， 平板双层类脂膜（BLM） 被普遍认为是所有生物膜的基本结构。但由于平板双层类脂膜寿命较短（通常只有几小时），这大大限制性了其在各领域的应用。直到近年来出现了具有较长寿命的固体支撑的双层类脂膜（s-BLM），才解决了传统BLM 生物传感器寿命短、稳定性差的缺点，支撑磷脂双层膜（s-BLM）制备简单，有良好的稳定性，用电化学方法研究支撑磷脂双层膜与物质的相互作用重现性较为理想， 在作用机理的推断方面有其独到之处，在生物传感器等方面也有着广泛的应用前景。利用循环伏安（CV）和交流阻抗（EIS）来研究s-BLM与生物分子［1］，药物分子［2］及离子［3，4］的作用已有相关报道。我们以玻碳电极支撑的卵磷脂双层膜（s-BLM）作为生物膜的模型，为探针分子，利用电化学方法研究了Al3+对卵磷脂双层膜电化学行为的影响，发现Al3+能诱导磷脂双层膜产生离子通道。并且发现作用后的s-BLM 在10mmol/L的柠檬酸三钠（Sodium citrate）溶液中能够自我修复，这表明采用强的鳌合剂从机体组织中将铝夺取，撤走铝离子则通道关闭。因此，采用强的鳌合剂从机体组织中将铝夺取，然后经代谢排出，有利于健康。对于进一步研制减轻人体内铝负荷的药物提供理论基础。

1、实验部分

1.1试剂及仪器

卵磷脂（PC）购于上海生物药业集团有限公司，氯化铝（AlCl3）购于上海化学试剂公司，柠檬酸三钠（Sodium citrate）购于北京化工厂；其他试剂都为分析纯，水为二次蒸馏水。

电化学实验采用三电极体系，其三电极系统是用裸玻碳电极或卵磷脂修饰玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）为参比电极；循环伏安测定在CHI832电化学工作站（美国）上进行，交流阻抗测定在VMP2电化学工作站（美国）上完成，Branson200超声清洗仪（美国）；石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）。

1.2玻碳电极支撑磷脂双层膜的制备

玻碳电极支撑磷脂双层膜的制备方法，将卵磷脂溶于氯仿中配制成20µg/µL的卵磷脂成膜贮备液，并在-4℃下保存，在磷脂双层膜制备之前，首先将玻碳电极分别用0.1，0.3和0.05µm的Al2O3抛光粉抛光至镜面，分别放入二次水和丙酮中超声清洗5分钟。然后，将预处理的玻碳电极浸入0.1mol/L KOH溶液并在1.5V的电压下极化3分钟，极化之后，玻碳电极表面用N2吹干。随后，将极化之后的电极浸入成膜液中30秒，取出立即浸入0.1mol/L KCl溶液，磷脂双层在玻碳电极表面形成，即可得到玻碳电极支撑磷脂双层膜。

1.3实验过程

循环伏安和交流阻抗实验在 1.0mmol/L的K3Fe（CN）6溶液中（0.1mol/L KCl为支持电解质）进行。工作电极分别为裸玻碳电极，PC修饰电极，与氯化钙作用后的PC修饰电极。交流阻抗实验在施加交流信号振幅为10mv，K3Fe（CN）6氧化还原电对的式电势（+0.225）下进行，频率范围200KHz-0.1Hz。

2、结果与讨论

2.1裸玻碳电极以及修饰了磷脂膜的玻碳电极的循环伏安响应

我们通过循环伏安方法来判断支撑磷脂双层膜的质量。图（1-a）显示了裸玻碳电极在含有0.1mol/L KCl的1.0mmol/L的Fe（CN）63-/4-溶液中的电化学响应。图（1-b）则为表面修饰了磷脂膜的玻碳电极在该溶液中的循环伏安响应。比较图（1-a）与图（1-b）可以发现，图（1-b）中所示的电极的循环伏安响应中，的峰电流几乎消失，说明到达电极表面发生反应的过程在一定程度上受阻，这证明在玻碳电极表面成功地制备出了支撑磷脂膜。

图1　玻碳电极在1 mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图； （a）裸玻碳电极， （b） 支撑磷脂双层膜的玻碳电极。扫描速度：50mV/s。

2.2修饰了磷脂膜的玻碳电极的交流阻抗响应

磷脂双层膜的形成可通过测定电极电容来确定，交流阻抗是研究修饰电极表面性质的一种有效的方法。图2是裸玻碳电极和PC修饰玻碳电极的阻抗图谱（Nyquist曲线）。可以看到裸玻碳电极的阻抗谱几乎表现为一条直线图（2-a）， 这说明探针分子非常容易到达电极表面发生反应，电极上不存在阻挡电子传递的物质，在裸GC电极上的反应是受扩散控制的，电化学反应较快。由图（2-b） 可以看出，当支撑磷脂膜存在时，其复平面阻抗图变为由电荷传递过程控制的一个半径较大的半圆，这表明形成磷脂膜后电荷传递电阻显著增大，膜内部不存在缺陷，探针分子不能通过电极表面的修饰膜，该过程几乎完全受动力学控制。由此证明，在玻碳电极表面成功地制备了支撑磷双层脂膜。

图2　玻碳电极在1 mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的阻抗图；（a）裸玻碳电极，（b）支撑磷脂双层膜的玻碳电极。

为了进一步研究修饰磷脂膜的玻碳电极所表现出来的阻抗信息， 我们选择加以改进的Randles等效电路［4］（如图2中插图）对测量结果进行拟合， 阻抗测量的结果由以下几个参数来决定：支持电解质电阻Rs、磷脂膜的电容Cm、磷脂膜的电阻Rm、双层电容Cdl、电荷传输电阻Rct 和Warburg元件ZW。通过拟合计算， 可得出磷脂膜的电容Cm ， 再根据磷脂的相对介电常数κ=2.05［6］， 真空介电常数ε0 =8.85×10-14F/cm， 由Eq.1的方程可得到磷脂膜的厚度d 。

从Eq.1中得出d的大小约为4.53nm， 这说明电极表面的磷脂膜的厚度为4.53nm。因为磷脂双层膜的厚度约为4-10nm［6］， 这进一步证明电极表面构筑的是磷脂双层膜。

2.3铝离子与支撑磷脂双层膜的相互作用

将修饰磷脂双层膜的玻碳电极浸入4mmol/L的氯化铝溶液中，分别放置不同时间后， 再将其放入1 mmol/L+0.1mol/L KCl溶液中进行循环伏安测试，其电化学响应如图3所示。

图3　修饰有 BLM 的玻碳电极与2mmol/L的氯化铝溶液作用不同时间后在1mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图；作用时间： （a） 0； （b）5； （c） 10； （d） 15； （e）25； （f） 35； （g） 40min； （h）45min； 扫速：50mV/s。

我们可以看到随着磷脂双层膜与氯化铝溶液的作用时间的增加， 循环伏安图中的氧化还原峰电流也不断增加， 这说明越来越容易到达玻碳电极表面， 并在玻碳电极表面发生了电子的传递， 由此推断铝离子可能与卵磷脂酸性头基之间相互作用，使卵磷脂分子自组装方位发生改变，有序排列程度降低，进而在s-BLM的表面产生一些微孔，探针分子通过通道到达电极表面，产生了伏安响应。

随后，又考察了修饰磷脂双层膜的玻碳电极与不同浓度的桑色素溶液作用10min后， 在1mmol/L+0.1mol/LKCl溶液中进行循环伏安扫描， 如图4所示。

图4　修饰有 BLM 的玻碳电极与不同浓度的氯化铝作用10min 后在1mmol/L Fe（CN）63-/4- +0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图；（a） 0；（b） 1.0； （c） 2.0； （d） 3.0 ；（e） 4.0 mmol/L；扫度： 50mVs-1.

由图4可以看到， 随着与磷脂双层膜作用的氯化铝溶液浓度的增加， 循环伏安图中的氧化还原峰电流也不断增加， 这说明与磷脂双层膜作用的氯化铝溶液浓度越大， 就有越多的探针分子能够到达玻碳电极的表面， 发生氧化还原反应， 在相同的时间内能够到达电极表面的探针分子数目越多， 磷脂双层膜产生的缺陷或孔洞越多。

2.4磷脂膜与铝离子作用后的自我修复

我们将与2mmol/L铝离子作用45min后的表面覆盖磷脂膜的玻碳电极放回到10mmol/L柠檬酸钠溶液中，每隔一段时间，将该电极取出再放到1mmolLK3Fe（CN）6溶液中扫描时，探针的氧化还原峰明显降低（如图5所示），随着与柠檬酸钠作用时间的延长，其伏安响应随时间的增加峰电流逐渐降低，最后膜几乎可以恢复到未与铝离子作用前的水平。这说明磷脂双层膜与铝离子作用产生离子通道在柠檬酸钠溶液中是可以自我修复，重新自组装的；由于A13+与柠檬酸盐的相互作用，能形成稳定的螯合物，使与磷脂头部作用的铝离子脱离后，磷脂分子重新自组装排列，膜恢复到作用前的状态，从而使探针不能到达电极表面产生伏安响应。

3 、结论

在玻碳电极表面构筑磷脂双层膜， 利用循环伏安（CV）和交流阻抗（EIS）技术判断磷脂双层膜的成膜情况，测试了磷脂双层膜与铝离子相互作用的研究，发现在刺激离子（Al3+） 存在时，该双层膜的通道打开，并随刺激离子浓度的增加、作用时间的延长，探针Fe（CN）63-/4-的伏安响应增大。并且作用后的磷脂双层膜在柠檬酸钠溶液中是可以自我修复，说明铝离子与磷脂双层膜之间的作用是可逆的，即没有刺激离子时，膜通道关闭，再现了生物膜的离子通道行为。

图5　修饰有BLM的玻碳电极在1mmol/L Fe（CN）63-/4 - + 0.1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图；（a）覆盖有磷脂膜的玻碳电极； （b）磷脂膜与2mmol/L铝离子作用45min 后； （c）与铝离子作后放入10mmol/L柠檬酸钠溶液中10min；（d） 30min；（e） 60min；扫速：50mV/s。

［1］赵静，廖天录，赵强.槲皮素在磷脂浇铸膜修饰玻碳电极上的电化学行为研究［J］.牡丹江师范学院学报：自然科学版，2011，75（2）：39-42.

［2］廖天录，赵强. 红霉素与DNA相互作用的电化学研究［J］.大庆师范学院学报， 2011，31（6）：45-47.

［3］赵强，廖天录，董稼的.5-氟尿嘧啶-1-乙酸与二价金属离子配合物研究. 大庆师范学院学报， 2010，31（6）：90-93

［4］廖天录，孙国禄，董会平.模拟生物膜上铅离子毒性机理的研究［J］.广东化工，2010，37（1）：53-55.

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2014年天水市市级科学技术研究与开发项目（第一批）阶段性研究成果