腺病毒LMP—3表达载体转染骨髓基质干细胞后BMP—2、OSX表达研究

安贵峰　王明月

【摘要】 目的 探讨骨矿化蛋白LMP-3促进骨形成及骨修复重建的分子机制。方法 通过腺病毒LMP-3表达载体转染骨髓间充质干细胞， RT-PCR法检测LMP-3、BMP-2、OSX表达变化， 检测相关因子表达情况。结果 腺病毒LMP-3表达载体转染骨髓基质干细胞， 发现BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表达增高， 促进骨形成。结论 LMP-3作用机制是通过上调BMP、OSX等骨诱导因子的基因表达， 促进成骨细胞分化成熟， 从而促进骨形成， LMP在骨形成研究方面具有一定潜力。

【关键词】 LMP-3， 骨髓基质干细胞；表达情况

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.22.207

LMP作为一种新发现的骨矿化蛋白， 为骨组织工程及骨科重建提供新的途径。研究者应用腺病毒LMP-3表达载体转染骨髓基质干细胞， 检测BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表达情况， 探讨骨矿化蛋白LMP-3促进骨形成的可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 主要试剂：PCR引物（上海生物）；兔抗大鼠LMP-3抗体（Santa Cruz） ；二抗羊抗鼠FITC标记IgG（中杉金桥）；胰酶（GIBCO）；RT-PCR试剂盒（Takara）；胎牛血清（HYCLONE）；DMEM（HYCLONE）；引物（上海生工）；质粒抽提试剂；MSC 诱导药物（Sigma）；腺病毒LMP-3表达载体前期自行构建。主要仪器：超净工作台（苏净）；恒温CO2孵箱（Hera Cell ）；倒置显微镜（日本 Olympus）；荧光显微镜（Olympus）；PCR仪（Bio-Rad）；垂直电泳仪（Bio-Rad）；转印电泳仪（Amersham）；可调温摇床（哈尔滨东联）；台式低温离心机（Eppendorf公司）；酶标仪（芬兰雷勃）。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 骨髓基质干细胞培养 取3周龄SD大鼠， 处死， 取股骨和胫骨， 注入PBS， 离心管收集， 250×g， 离心10 min， 加入100 g/L 高糖DMEM 10 ml。接种于2 个25 cm2 培养瓶中， 培养箱中培养；48 h换液， 10 d 后细胞80%汇合， 胰蛋白酶消化传代， 继续培养， 培养箱中培养。

1. 2. 2 实验组感染复数（MOI=100）；对照组：未加病毒转染作为阴性对照组， LacZ 转染组作为阳性对照。

1. 2. 3 转染过程 将第3 代MSC 传代与12 个6 孔板中（5×104 cells /孔）， 加入病毒液， 轻摇1 min， 继续培养， 12 h 后换液， 2 d后更换新鲜培养基， 5 d后更换新鲜培养基， 换液并留取检测。8 d后更换培养液， 12 d后再次换液并留取检测。

1. 2. 4 RT-PCR检测LMP-3、BMP-2、OSX在MSC 中的表达情况 总RNA的提取， 实验分组A Ad-LMP-3组B Ad-LacZ组C阴性对照组。细胞裂解， 离心并弃上清液， 溶解RNA后进行RNA的定量及保存， 测量光密度值并计算浓度。首先合成第一链cDNA， 并以第一链cDNA为模版继续PCR扩增， 反转录操作按照试剂盒的说明书进行操作， 30个循环；以β-actin为内参照；LMP-3引物序列如下：Forward： 5-GCCTCGAGGAAGATG CAC CCATGT CCTC-3；Reverse： 5-GCGAATTCCTACATC CTGTAGTTCTTGTTTC -3。琼脂糖凝胶电泳检测， 取实验组及对照组PCR产物进行电泳检测， 电泳结束后取反应产物进行染色并进行灰度扫描， 检测信号强度依据电泳条带面积及灰度强度进行比较， 检测LMP-3、BMP-2、OSX和β-actin灰度比值表示LMP-3、BMP-2 mRNA、OSX mRNA表达水平。

2 结果

腺病毒LMP-3载体转染骨髓基质干细胞后， 可见长多角形细胞生长， 增殖旺盛。进一步应用RT-PCR法检测LMP-3 mRNA、BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表达RT-PCR结果显示， 序贯转染Ad-LMP-3组存在特异性条带， 大小1200 bp， 表达的浓度显著高于对照组。序贯转染Ad-LMP-3组在456 bp

的位置存在特异性条带， 表明BMP-2 mRNA表达增高， 表达的浓度高于对照组。Ad-LMP-3组特异性条带， 大小488 bp， 显示 OSX mRNA表达较高， 对照组未见特异性条带， 表明无OSX mRNA表达。研究结果表明腺病毒LMP-3载体转染骨髓基质干细胞， LMP-3表达增高， 表明转染成功， 转染组BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表达增高表明LMP-3促进了骨髓基质干细胞中BMP-2、OSX表达， 从而促进了骨形成。

3 讨论

LIM矿化蛋白是新发现的一种细胞内非分泌蛋白， 具有骨生成诱导的作用， 能够正性调节骨形成诱导， 在骨矿化过程中促进骨结节的形成。LIM矿化蛋白LIM矿化蛋白已经发现3种亚型， 具有成骨作用包括LIM矿化蛋白-1和LIM矿化蛋白-3 [1]。LIM矿化蛋白能够促进骨形成的作用， 可能是再骨形成细胞内传导通路实现的， 并通过下游细胞调节因子发挥骨形成作用， 但其确切促进骨形成分子机制仍需要进一步研究证明 [2]。

研究者成功应用腺病毒LMP-3表达载体转染骨髓基质干细胞， 并检测LMP-3转染后各组骨髓基质干细胞中相关目的基因mRNA表达情况， 研究发现BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表达增高。骨矿化蛋白LMP-3是通过上调BMP、OSX骨诱导因子的基因表达而实现LMP-3的促进骨形成作用， 促进骨钙化结节形成， 在骨形成及骨矿化过程中发挥重要作用。研究结果表明 LMP-3是OSX的上游调节因子， 通过上调BMP-2、OSX表达， 通过细胞内信号传导促进成骨细胞分化成熟， 促进骨钙化结节形成。LMP-3通过细胞内调控及信号传导， 不受成骨前体细胞表面受体数量和活性的限制， 不受细胞外因子作用浓度及数量限制， 在促进骨形成作用更强， 可能同时促进BMP-4， BMP-6等其他细胞因子分泌， 激联促进骨形成， 作用时间更加持久， 作用强度更强， 受细胞外因子影响更小。通过对LIM矿化蛋白的促进骨形成进一步分子机制研究， 以及进一步进行基因敲除及实验动物的体内成骨研究， 对进一步探索其在骨形成、骨缺损及脊柱融合等方面的作用奠定基础， 对骨矿化蛋白LMP-3促进骨形成的作用研究及进一步临床应用具有重要意义。

本研究表明， LMP通过作用骨诱导因子BMP-2、OSX共同通过细胞信号传导通路促进成骨， 促进骨钙化结节形成， 在骨形成过程中具有重要作用， 其促进骨形成的作用更强， 但仍需要进一步体内实验研究来阐明确切生物学机制。

参考文献

[1] Minamide A， Boden SD， Viggeswarapu M， et al. Mechanism of bone formation with gene transfer of the cDNA encoding for the intracellular protein LMP-1. J Bone Joint Surg Am， 2003， 85-A（6）：1030-1039.

[2] Pola E， Gao W， Zhou Y， et al. Efficient bone formation by gene transfer of human LIM mineralization protein-3. Gene Ther， 2004， 11（8）：683.

[收稿日期：2016-03-09]