两种碱性pH调节剂对1，3-丙二醇发酵过程的影响

张霖，樊亚超，李晓姝，廖莎，王鹏翔，乔凯（中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺113001）

研究开发

两种碱性pH调节剂对1，3-丙二醇发酵过程的影响

张霖，樊亚超，李晓姝，廖莎，王鹏翔，乔凯
（中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺113001）

氢氧化钠、氢氧化钙作为碱性pH调节剂，被广泛应用于发酵行业。两种pH调节剂在发酵过程中形成的有机酸盐，其溶解性存在显著差异，从而间接影响发酵过程。本文重点考察了两种碱性pH调节剂对1，3-丙二醇发酵过程的影响，通过发酵液渗透压、尾气组成、发酵周期、生产强度等过程参数的试验考察，分析了可溶性强碱作为pH调节剂不利于1，3-丙二醇发酵的原因，并且在以氢氧化钠作为pH调节剂的发酵体系中，考察了区间厌氧发酵方案的可行性。从氢氧化钠pH调控下的发酵周期来看，约21h后转入发酵末期，发酵活跃期相对较短，因此缩短发酵周期，有利于提高平均生产强度。另外，通过区间厌氧通气方案，能够进一步减少氮气使用量，提高该工艺的经济性。

1，3-丙二醇；pH调节剂；发酵；厌氧

1，3-丙二醇（1，3-propanediol，PDO）主要用于生产性能优异的新型聚酯——聚对苯二甲酸丙二醇酯（polytrimethylene terephthalate，PTT）［1-2］。1，3-PDO工业生产方法主要有化学法和生物法两大类［3］，生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等优点，是一种生产成本低、污染少的方法［4-5］。

以甘油为底物，经生物转化法制备1，3-PDO过程中，副反应较多，产生大量的副产物有机酸［6］。胡秋龙［7］、徐卫涛［8］、PETROV［9］等研究了pH对克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油产 1，3-PDO的影响与控制，证明了pH控制对菌体生长、产物和副产物的生成有着重要影响。修志龙［10］设计了3种pH调控方式，考察了钠离子、钾离子和铵离子对甘油连续生物歧化过程的影响。目前氢氧化钠、氢氧化钙、氨水等碱性pH调节剂被大量应用于1，3-PDO发酵过程。研究表明，单纯以1，3-PDO产物浓度作为评价指标，相同实验条件下，氢氧化钙作为pH调节剂的实验效果明显优于氢氧化钠，但是氢氧化钙作为pH调节剂使用，在发酵后期以及产品提取过程中，必然会形成大量的钙盐形式固体废物，固体废物的处理提高了该工艺的生产成本，从而降低了经济性，影响其工业应用。相对而言，以氢氧化钠作为pH调节剂，发酵工艺实施过程中形成的固体废物很少，因此该工艺更具应用前景。

本文通过对比实验分析了氢氧化钙、氢氧化钠两种pH调节剂对发酵过程的影响，在此基础上，为提高氢氧化钠pH调节模式应用效果，针对其发酵特征，设计并考察了氢氧化钠pH调节模式下的区间厌氧发酵方案的可行性。

1　材料与方法

1.1菌种

本实验中所用的菌种为肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsieblla pneumoniae），来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种在中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）保藏，保藏号为0798。

1.2培养基

种子培养基：甘油20g/L，NH4Cl 4.28g/L，KCl 0.6g/L，NaH2PO4·H2O 1.1g/L，Na2SO40.23g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸0.34g/L，酵母膏1g/L，Vc 0.1g/L。pH=7.0。

发酵培养基：甘油 40g/L，NH4Cl 5.35g/L，KCl 0.75g/L，NaH2PO4·H2O 1.38g/L，Na2SO40.28g/L， MgCl2·6H2O 0.26g/L， CaCl2·H2O 0.0029g/L，柠檬酸 0.42g/L，酵母膏 1.2g/L，Vc 0.1g/L。pH=7.0。

1.3菌种培养

采用1L种子罐进行种子培养。接种量为1%。培养控制条件：温度为37℃，搅拌速度为400r/min，以5mol/L NaOH调节pH，使其控制为7.0，培养周期16h。

1.4发酵方法

发酵罐体积选择 2.5L、15L，采用批次发酵模式。接种量为10%。发酵控制条件：温度为37℃，搅拌速度为400r/min，以5mol/L NaOH或5mol/L Ca（OH）2进行pH调节，使其控制为7.0，发酵周期30～48h。过程中定时取发酵液进行液相分析，并根据分析结果补加甘油，使甘油浓度维持在 15～25g/L。

1.5分析方法

（1）液相分析以 Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX-87H，用于分析反应体系中底物甘油的消耗情况、产物1，3-PDO以及主要副产物乙酸、琥珀酸等的积累情况。流动相为0.005mol/L硫酸溶液，流速0.5mL/min，柱温40℃。

（2）气相分析安捷伦7890型气相色谱，采用热导检测器，用于气体组成分析。载气为高纯氦气，柱温50℃，进样器和检测器温度分别为150℃、200℃。

（3）生物量测定采用细胞干重方法，将4mL的发酵液加入烘干至恒重的 5mL离心管中，3000r/min离心 30min，弃去上清液，敞口放置于80℃烘箱中，烘干至恒重，增量就是细胞的干重，每个浓度取3次平行，最后计算平均值。

2　结果与讨论

2.1两种pH调控模式下通气单因素试验考察

试验中设置微氧、厌氧两种发酵模式，分别考察氢氧化钙、氢氧化钠作为pH调节剂的两种发酵模式，在发酵周期内各种通气方案对1，3-PDO发酵水平的影响。其中厌氧发酵模式采用通入氮气的形式，通气量分别为0.1vvm、0.2vvm、0.4vvm、0.6vvm （vvm为每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值）。

氢氧化钙pH调控模式下通气单因素试验结果见表1。

仅以1，3-PDO最终产量来看，氢氧化钙作为pH调节剂的发酵模式，通入氮气的厌氧发酵结果要明显好于微氧发酵，厌氧发酵1，3-PDO发酵平均浓度应大于70g/L；从试验数据来看，增加氮气通气量，其发酵水平略有提高，比较0.2vvm和0.4vvm两种通气形式，氮气通气量提高一倍，1，3-PDO的产量提高10.3%。

表1　氢氧化钙pH调控模式下通气量对1，3-PDO发酵水平的影响

氢氧化钠pH调控模式下通气单因素试验结果见表2。

表2　氢氧化钠pH调控模式下通气量对1，3-PDO发酵水平的影响

以1，3-PDO最终产量来看，氢氧化钠作为pH调节剂的发酵模式，通入氮气的厌氧发酵结果要明显好于微氧发酵，厌氧发酵1，3-PDO发酵平均浓度应大于50g/L；从试验结果来看，增加氮气通气量，对其发酵水平影响不大，0.1～0.6vvm通气量条件下，1，3-PDO产量保持在50～55g/L水平。

两种pH调控模式对发酵周期、生产强度的影响结果见图1、图2。

图1　两种pH调节下PDO产出情况

图2　氢氧化钠pH调控模式下通气对发酵周期的影响

从发酵全周期来看，分为发酵活跃期和发酵末期两个阶段，在氢氧化钙pH调控体系下，发酵活跃期和发酵末期以30h为分界点，此时的1，3-PDO产量即可达到最终产量的92%。

从试验结果来看，厌氧发酵模式的发酵活跃期维持时间要明显长于微氧发酵模式，氢氧化钙pH调控模式下的发酵活跃期维持时间要明显长于氢氧化钠pH调控模式。

从氮气通气量角度来看，0.2～0.4vvm的通气量变化对发酵活跃期的影响并不明显。

从氢氧化钠pH调控下的发酵周期来看，发酵活跃期和发酵末期的分界时间点为21h左右，发酵活跃期相对较短；在该调控体系下，厌氧发酵模式的1，3-PDO产量具有明显优势，但氮气通气量的增加，对其发酵水平并未产生同比增长。

2.2两种pH调控模式下发酵液盐浓度考察

按照1.4节的实验条件考察试验发酵周期内发酵液电导率变化情况，以溶液电导率表征溶液盐离子浓度，结果见表3。

从试验结果来看，随着发酵周期的延长，发酵体系中盐离子浓度呈增加的趋势；结合对应批次副产物有机酸的产出情况发现，9～18h是副产物有机酸及1，3-PDO生产强度最大的时间段，因此可以对溶液盐浓度增加的现象进行合理的解释；相比较而言，氢氧化钠pH调控模式下，其盐离子浓度增加的更加明显，其浓度增加 44.11%远高于氢氧化钙pH调控模式下的17.82%，主要原因在于钙盐的溶解性要明显低于对应的钠盐；试验结果从渗透压影响菌体生长角度，能够解释氢氧化钙pH调控模式在1，3-PDD发酵水平上具有优势的原因。

表3　发酵周期内发酵液电导率变化情况

2.3两种pH调控模式下的尾气分析

针对实验过程中两种pH调控模式下的尾气进行分析，结果见表4及表5。

表4　氢氧化钠pH调控模式第10批次发酵尾气分析

表5　氢氧化钙pH调控模式第4批次发酵尾气分析

从尾气中CO2含量分析来看，氢氧化钙pH调控模式下4～16h内CO2含量要明显高于同期氢氧化钠pH调控模式下的CO2含量。一方面，氢氧化钙较氢氧化钠更易于吸收CO2形成沉淀，降低CO2含量；另一方面，CO2主要来源于菌体代谢中的脱羧反应，菌体活性越强其反应越强烈。综合来看，该试验结果也验证了氢氧化钙pH调控利于延长发酵活跃期，从而提高1，3-PDO产量。

2.4氢氧化钠pH调控模式下区间厌氧发酵试验

结合试验菌种生长曲线，将发酵周期分为延滞期（0～4h）、菌体生长期（4～8h）、发酵活跃期（8～22h）、发酵末期（22～36h）。在氢氧化钠pH调控体系下，通过在不同阶段厌氧控制，考察区间厌氧方式对发酵水平的影响，结果见表6。

表6　氢氧化钠pH调控模式下区间厌氧发酵情况

从区间厌氧发酵试验结果来看，延滞期、菌体生长期的厌氧通气控制，对提升发酵水平的作用不大，而发酵活跃期保持厌氧通气控制，能够明显提升发酵水平。

区间厌氧发酵过程中，副产乙酸、琥珀酸的情况见图3、图4。

图3　区间厌氧发酵中副产乙酸浓度随时间的变化

图4　区间厌氧发酵中副产琥珀酸浓度随时间的变化

从图3、图4中可以看出，发酵活跃期进行厌氧通气控制，其副产物乙酸、琥珀酸的产量明显增加。由于乙酸代谢有利于1，3-PDO的生成，因此证明了发酵活跃期厌氧控制有利于提高发酵水平。虽然在氢氧化钠pH调控模式下，副产物有机酸浓度增加，会增加发酵液中离子浓度，影响发酵体系渗透压，但是由于厌氧通气所使用的氮气，能够携带出CO2气体，降低了溶液酸性，因此综合分析，发酵活跃期的区间厌氧通气方案，能够进一步提升发酵水平。

3　结　论

（1）从提高 1，3-PDO发酵水平角度来看，氢氧化钙pH调控模式要优于氢氧化钠pH调控模式，通过尾气、溶液离子浓度、发酵周期、生产强度等过程参数分析对上述现象能够进行合理解释。

（2）从氢氧化钠pH调控下的发酵周期来看，其发酵活跃期和发酵末期的分界时间点为 21h左右，发酵活跃期相对较短，因此缩短发酵周期，提高平均生产强度，有利于该调控方案的工业化应用。

（3）与微氧相比，厌氧发酵模式有助于提高发酵水平，其中氮气通气量以 0.4vvm为限，单纯增加通气量未必获得等比效果。

（4）在氢氧化钠pH调控模式下，可以将发酵周期分为延滞期、菌体生长期、发酵活跃期、发酵末期，通过区间厌氧通气方案的设计，在提高发酵水平的前提下，进一步减少氮气使用量，能够提高该工艺方案的经济性。

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Effects of two alkaline pH regulators on the fermentation of 1，3-propanediol

ZHANG Lin，FAN Yachao，LI Xiaoshu，LIAO Sha，WANG Pengxiang，QIAO Kai
（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，FRIPP，SINOPEC，Fushun 113001，Liaoning，China）

As alkaline pH regulators，sodium hydroxide and calcium hydroxide are widely applied in fermentation industry. In the fermentation process，these two pH regulators produce organic acid salts with significantly different solubility，which can indirectly affect the fermentation process. This study focused on investigating the effects of two alkaline pH regulators on the 1，3-propanediol fermentation process. Through laboratory investigations on the process parameters （including osmotic pressure of the fermentation liquor，composition of tail gas，fermentation period and production intensity），the negative effect of using soluble strong alkali as pH regulator in 1，3-propanediol fermentation has been analyzed. The feasibility of interval anaerobic fermentation has also been examined using sodium hydroxide as pH regulator，and the fermentation grows into its end stage after about 21 hours within one period. So，the active stage of fermentation is relatively short，and shortening the fermentation period should be helpful to raise the production intensity. In addition，by ventilation during the interval anaerobic fermentation，the use of nitrogen can be further reduced to improve the economical efficiency of this process.

1，3-propanediol；pH regulator；fermentation；anaerobic

TQ 923

A

1000-6613（2016）08-2542-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.08.38

2016-04-08；修改稿日期：2016-05-11。

及联系人：张霖（1981—），男，硕士研究生，工程师。E-mail zhl.fshy@sinopec.com。