长枝木霉菌株T05发酵液抑菌力参数筛选1)

吉海龙　　　　　　　伊洪伟　　　　池玉杰

(东北林业大学，哈尔滨，150040)　　　(重庆市农业科学院果树研究所)　　　(东北林业大学)



长枝木霉菌株T05发酵液抑菌力参数筛选1)

吉海龙伊洪伟池玉杰

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(重庆市农业科学院果树研究所)(东北林业大学)

为了得到抑菌活性更高的发酵液，研究了长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)菌株T05发酵液及发酵液乙酸乙酯提取物对灰霉病菌(灰葡萄孢(Botrytiscinerea))和杨树烂皮病菌(污黑腐皮壳(Valsasordida))的抑菌活性，并以V.sordida作为指示菌对发酵液的培养时间、培养温度、初始pH值、接菌量这4项指标进行了筛选。结果表明：T05发酵液对B.cinerea和V.sordida都有一定的抑制作用，对B.cinerea的最高抑菌率为PDB发酵液过滤除菌后在48 h的55.48%，对V.sordida的最高抑制率为改良马丁培养基发酵液过滤除菌后48 h的48.68%；培养7 d的发酵液乙酸乙酯提取物对2种病原菌的抑菌作用更为显著，在24 h的抑菌率都为100%，在96 h时对2种病原菌的抑菌率分别为84.1%和82.6%，均表现出极强的抑菌活性。筛选后获得最高抑菌率的最佳发酵组合为：培养时间6 d、温度28 ℃、初始pH=6、500 mL的三角瓶装液量250 mL的条件下接菌量为0.5 mL。在该条件下T05发酵液的乙酸乙酯提取物在96 h对V.sordida的抑菌率从82.9%上升到99.0%。

长枝木霉；液态发酵；抑菌活性；参数筛选；杨树烂皮病菌

We studied the antifungal activity of fermentation broth and its ethyl acetate extracts ofTrichodermalongibrachiatumstrain T05, and screened and optimized four parameters including culture time, culture temperature, the initial pH value, and the initial inoculum volume by usingValsasordidaas an indicator pathogen to get higher antifungal activity of the fermentation liquid. The fermentation broth of T05 could inhibit both Botrytis cinerea andV.sordida, the highest inhibition rate toB.cinereawas 55.48% by 48 h after the fermentation broth in PDB was removed bacteria by filter, whereas, the highest inhibition rate toV.sordidawas 48.68% by 48 h after the fermentation broth in Martin medium was removed bacteria by filter. The ethyl acetate extracts of T05 fermentation broth after culturing for 7 d had a stronger antifungal activity both toB.cinereaandV.sordida, the inhibition rate by 24 h were both 100%, and the highest inhibition rate by 96 h were 84.1% and 82.6%, respectively. After screening the optimal parameter combinations to get the highest inhibition rate were: culturing for 6 days, culture temperature of 28 ℃, the initial pH of 6, and the initial inoculum volume of 0.5 mL in 500 mL conical flask bottled 250 mL medium, and the inhibition rate at 96 h was increased from 82.9% to 99%.

木霉菌(Trichodermaspp.)是一类广谱的生防真菌，利用木霉菌防治植物真菌病害的机制是多种多样的，不同的木霉菌株表现出不同的生防能力。木霉菌对多种植物病原菌都有较好的防治效果[1]，在蔬菜和水果病害防治上的应用是很多的，如番茄灰霉病、黄瓜苗期立枯病、豇豆炭疽病、莴苣小菌核病等[2-4]，在对草莓灰霉病的防治中也取得了可喜的成果[5]。木霉能够通过营养和空间竞争、重寄生、抗生作用、诱导抗性、协同拮抗作用等机制抑制病原菌的生长，木霉固体和液体发酵产生的次级代谢产物对多种植物病原菌均具有高效的抑制作用，是生防的重要作用机制之一[6-7]，如绿木霉(T.virens)发酵液乙酸乙酯提取物对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的抑制效果在48 h分别达到63.6%和62.0%[8]，因此获得较为理想的抑菌发酵条件也是实现木霉广泛应用的前提，培养温度、初始pH值、培养时间、接菌量都是影响木霉菌株液体发酵产物种类和含量较重要的指标[9-10]。笔者研究了长枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T05对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和杨树烂皮病菌(Valsasordida)对峙生长的抑菌活性、挥发性物质和4种分生孢子提取物的抑菌效果，揭示了其部分抑菌机制，本研究继续对菌株T05的发酵液及发酵液乙酸乙脂提取物的抑菌活性进行了研究，以进一步揭示其抑菌机理，并在此基础上，用改良马丁培养基培养菌株发酵液，对培养温度、初始pH值、培养时间、接菌量4个影响发酵产物种类和含量的关键因素进行了优化筛选，目的为得到抑菌活性更高的发酵液，其中能产生更多、更有效的抑菌活性成分，为今后实现长枝木霉菌剂的广泛应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌种来源和培养基

菌种来源：长枝木霉菌株T05，是自我采集、自行分离得到的1株木霉菌株；杨树烂皮病菌自我采集于哈尔滨市道边杨树并分离得到；灰霉病菌由他人惠赠。以上所有菌种保存于PDA斜面上存放于东北林业大学森林病虫病理实验室(4 ℃)。

培养基：PDA培养基(去皮马铃薯200 g煮汁，琼脂20 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)；PDB培养基(去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)；改良马丁培养基(蛋白胨5.0 g，K2HPO4·3H2O为1.0 g，酵母浸出粉2.0 g，MgSO4·7H2O为0.5 g，葡萄糖20.0 g，加水定容至1 L)。

1.2T05发酵液抑菌性能的测定

将分别用PDB和改良马丁培养基培养7 d(180 r·min-1、25 ℃下摇床培养)的T05发酵液，用4层无菌纱布过滤，分别各取100 mL滤液经高压灭菌(121 ℃，20 min)和经细菌过滤器(0.22 μm)除细菌和孢子后，用移液器取1 mL滴于PDA平板上，并用灭菌的刮涂器涂抹均匀，然后在平板中心处接种直径为10 mm的B.cinerea和V.sordida菌饼，用十字交叉法每隔24 h观测菌落生长直径，设3次重复，以1 mL无菌水涂抹平板作为对照。抑菌率计算公式为：抑菌率=((病原菌对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径)×100%。

1.3T05发酵液乙酸乙酯提取物抑菌性能的测定

将在PDA平板上生长7 d的T05分生孢子，用10 mL无菌水洗下，用血球计数器调制成浓度为107菌落·mL-1的孢子悬浮液，接种1 mL孢子悬浮液到装有250 mL改良马丁培养基的500 mL三角瓶中，3个重复，恒温振荡培养(180 r·min-1、25 ℃)7 d后，将发酵液用4层无菌纱布过滤得到菌丝并测其干质量，将滤液按体积比1∶1与乙酸乙酯混合，在恒温振荡培养箱(200 r·min-1、25 ℃)萃取1 d后去除无机相，减压旋转蒸发去除有机相，然后用20 mL 10%的Tween 80溶液溶解萃取物，将所得的浓缩液用0.22 μm滤膜除菌后与100 mL 50 ℃的PDA培养基混合后倒平板(一般倒3个平板)，接种直径10 mm的B.cinerea和V.sordida菌饼，以20 mL 10%的Tween 80除菌后与100 mL 50 ℃的PDA培养基混合后倒平板、接种直径10 mm的病原菌作为对照。每个处理3个重复，于生化培养箱中25 ℃培养，每24 h用十字交叉法测量菌落直径，根据1.2的公式计算抑菌率。

1.4T05发酵液的抑菌力条件筛选

1.4.1培养时间对菌丝生物量和发酵液提取物抑菌性能的影响

按照1.3的方法，将菌株T05分别发酵培养至2、4、6、8、10、15、20 d，测菌丝干质量，发酵液获得乙酸乙酯萃取物后，将V.sordida做为指示病原菌，检测96 h的抑菌率。

1.4.2培养温度对菌丝生物量和发酵液提取物抑菌性能的影响

按照1.3的方法，在1.4.1获得最佳培养时间的基础上，分别在15、20、25、28、30、35、40 ℃进行发酵培养，测菌丝干质量，发酵液获得乙酸乙酯萃取物后，检测96 h对V.sordida的抑菌率。

1.4.3初始pH对菌丝生物量和发酵液提取物抑菌性能的影响

按照1.3的方法，在获得最佳培养时间和最适培养温度的基础上，将培养液初始pH值调为2、4、6、8、10、12、14，在各pH进行发酵培养，测菌丝干质量，发酵液获得乙酸乙酯萃取物后，检测96 h对V.sordida的抑菌率。

1.4.4接菌量对菌丝生物量和发酵液提取物抑菌性能的影响

按照1.3的方法，在获得最佳培养时间、最适培养温度和最适初始pH值的基础上，在初始接菌量分别为0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mL的条件下进行发酵培养，测菌丝干质量，发酵液获得乙酸乙酯萃取物后，检测96 h对V.sordida的抑菌率。

2　结果与分析

2.1T05发酵液的抑菌性能

在PDB和改良马丁培养基内培养7 d的T05发酵液，分别经高压灭菌和细菌过滤器除菌后对B.cinerea和V.sordida的抑菌结果见表1。由表1可知，T05的发酵培养液分别经高压灭菌和细菌过滤器除菌后，对2种病原菌都有一定的抑制作用，表明菌株T05能够产生一些抑菌物质；过滤除菌的抑菌率都高于高压灭菌的抑菌率，表明一些抑菌物质是热稳定性的，而另一些是热不稳定性的。2种培养基的发酵液经高压灭菌后，对2种病原菌的抑制基本上都是随着时间的变化而逐渐减弱，都是在24 h的抑菌率最高；而2种培养基的发酵液经过滤器除菌后分别对2种病原菌的抑制差别不大，都是在48 h达到最高，然后逐渐下降。其中PDB发酵液过滤除菌后对B.cinerea的最高抑菌率为48 h的55.48%，改良马丁培养基发酵液过滤除菌后对V.sordida的最高抑制率为48 h的48.68%。

表1　T05发酵液对B. cinerea和V. sordida的抑制

2.2T05发酵液乙酸乙酯提取物的抑菌性能

在改良马丁培养基内培养7 d的T05菌株发酵液，经乙酸乙酯萃取后对B.cinerea和V.sordida的抑菌结果见表2。由表2可知，T05发酵液产生的活性物质经乙酸乙酯萃取后对2种病原菌都表现出极强的抑菌活性，在24 h的抑菌率都为100%，以后随着时间的延长缓慢下降。试验发现，B.cinerea在60 h后开始缓慢生长，V.sordida在48 h后开始逐渐生长，发酵液的抑菌活性物质在96 h时对2种病原菌的抑菌率分别为84.1%和82.6%，以后逐渐下降。

表2T05发酵液乙酸乙酯提取物对B.cinerea和V.sordida的抑制

培养时间/hB.cinerea处理直径/cm对照直径/cm抑菌率/%V.sordida处理直径/cm对照直径/cm抑菌率/%240 0.48100.00 1.92100.04801.51100.00.092.8796.7720.152.7594.50.475.0590.7960.543.3984.11.357.7982.6

2.3T05不同液体发酵条件下菌丝生物量和抑菌性能

2.3.1不同培养时间的菌丝生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05发酵培养至不同时间的菌丝干质量和发酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率见表3。由表3知，T05生长很快，最初随着时间的延长生物量增加，到第6天达到最高，为7.121 g·L-1，以后又逐渐下降。从宏观上可以看到，接菌1 d后三角瓶中就出现呈球状的菌丝体，3 d后可以观察到大量菌丝体且培养基颜色逐渐加深呈黄色，10 d后培养基颜色逐渐变为红褐色；从第2天开始T05产生的代谢物质就能对病原菌产生抑菌作用，随着时间的推移代谢产物逐渐积累，其抑菌能力也在不断的增强，96 h在第6天时的抑菌能力达到最强，抑菌率高达82.90%，以后随后随着培养时间的延长抑菌能力逐渐降低。不同培养时间的发酵液提取物对病菌生长状态的影响也不同。因此，在25 ℃条件下，产菌丝生物量和抑菌活性物质的最佳发酵时间均为6 d。

表3培养时间对T05菌丝生物量和发酵液抑菌率的影响

培养时间/d菌丝干质量/g·L-1抑菌率/%25.71064.1045.84371.4067.12182.9086.68374.80105.63268.30154.67165.40204.42764.10

2.3.2不同温度的菌丝生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同培养温度的菌丝干质量和发酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率见表4。由表4可知，T05在15～40 ℃均能生长，适当低温更有利于菌丝的生长，在20 ℃时其菌丝干质量达到最大，为7.956 g·L-1，以后继续增加培养温度其菌丝干质量逐渐减少；T05在不同温度下产生的代谢物质对病原菌均有不同程度的抑菌作用，96 h的抑菌率为53.7%～87.4%，初期随着培养温度的增加抑菌能力逐渐增加，当温度增至28 ℃时抑菌活性达到最高，抑菌率为87.4%，以后随着培养温度的增加抑菌能力缓慢下降。因此，在不同培养温度条件下6 d时，产菌丝生物量和抑菌活性物质的最佳发酵温度分别为20、28 ℃。

表4培养温度对T05菌丝生物量和发酵液抑菌率的影响

培养温度/℃菌丝干质量/g·L-1抑菌率/%156.54653.70207.95679.60257.55383.00287.12187.40306.29085.90355.54382.70405.34177.20

2.3.3不同初始pH值的菌丝生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同初始pH值下的菌丝干质量和发酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率见表5。由表5可知，过酸或过碱都不利于菌丝的生长，从pH等于2开始，随着pH值的增加，T05菌丝的生物量也随之增加，当pH为6时，菌丝产量达到最大，为7.433 g·L-1。当pH继续增加，菌丝生物量随之下降；过酸或过碱也不利于抑菌活性物质的产生，当pH=6时，发酵液的抑菌能力最强，96 h的抑菌率高达93.9%，因此，在最佳发酵时间为6 d、最佳发酵温度为28 ℃的培养条件下，产菌丝生物量和抑菌活性物质的最佳初始pH值均为6。

表5初始pH值对T05菌丝生物量和发酵液抑菌率的影响

初始pH值菌丝干质量/g·L-1抑菌率/%23.46745.2045.73362.5067.43393.9087.16688.30104.66763.40122.93345.50140.4072.60

2.3.4不同接菌量的菌丝生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同接菌量的菌丝干质量和发酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率见表6。由表6可知，当接菌量为0.10 mL时，菌丝干质量达到最大，为7.682 g·L-1，以后随着接菌量的继续增加，菌丝体产量出现了下降，但变化不大；当接菌量为0.50 mL时，其抑菌活性在96 h高达99.00%，病原菌几乎没有生长。因此，在最佳发酵时间为6 d、最佳发酵温度为28 ℃、最佳初始pH值为6的培养条件下，产菌丝生物量和抑菌活性物质的最佳接菌量分别为0.10、0.50 mL。

表6　接菌量对T05菌丝生物量和发酵液抑菌率的影响

3　结论与讨论

木霉作为一类重要的生防菌，其对病原菌的防治机制是多种多样的，木霉在液体发酵过程中可以产生丰富的代谢产物，这些代谢产物对病原菌有抑制作用，因此研究其发酵液的抑菌活性也是探索其拮抗机制的一个重要方面。本试验中长枝木霉菌株T05的发酵液经高压灭菌和过滤器除菌后，对灰霉病菌和杨树烂皮病菌都有一定的抑制作用，过滤除菌的抑菌率高于高压灭菌的抑菌率，表明菌株T05能够产生一些抑菌物质，其中一些抑菌物质是热稳定性的，而另一些是热不稳定性的。对B.cinerea的最高抑菌率为PDB发酵液过滤除菌后在48 h的55.48%，对V.sordida的最高抑制率为改良马丁培养基发酵液过滤除菌后在48 h的48.68%；而培养7 d的发酵液乙酸乙酯提取物对2种病原菌的抑菌作用更为显著，在24 h的抑菌率都为100%，在96 h时对2种病原菌的抑菌率分别为84.1%和82.6%，均表现出极强的抑菌活性。有研究表明，哈茨木霉(T.harzianum)发酵液的乙酸乙酯提取物可以降低致病疫霉(Phytophthorainfestans)菌体可溶性蛋白含量，降低保护酶活性，这是抑制病原菌的机理之一[11]。

本试验也以V.sordida作为指示菌，采用改良马丁培养基，从培养时间、培养温度、初始pH值、接菌量这4项影响发酵产物种类和含量的关键因素指标出发，对T05发酵液的菌丝生物量和抑菌活性物质的最佳发酵条件参数进行了筛选，目的为得到抑菌活性更高的发酵液，能产生更多、更有效的抑菌活性成分。筛选后菌株T05获得最高抑菌率的最佳发酵组合为：培养时间6 d、温度28 ℃、初始pH值为6、500 mL的三角瓶装液量250 mL的条件下接菌量为0.5 mL，经过逐级优化筛选后，使T05发酵液的乙酸乙酯提取物在96 h对V.sordida的抑菌率从82.9%上升到99%，病原菌几乎没有生长。获得最高菌丝生物量的最佳发酵组合为：培养时间6 d、温度20 ℃、初始pH值6、500 mL的三角瓶装液量250 mL的条件下接菌量为0.10 mL。

有研究显示，随着培养时间的增加，木霉菌丝体生物量增加到最大值后逐渐下降。本试验也发现，木霉菌株T05的菌丝生物量最初随着时间的延长而增加，直到第6天达到最大值后又逐渐下降，其对V.sordida的抑菌率也在第6天达到最大值后逐渐下降，这与菌丝体的生长规律比较相似，推测原因可能是初期菌丝生物量与抑菌活性物质基本同步增加，但是随着时间的延长、基质中营养物质的减少，菌丝体出现自溶现象直到生长停止，代谢产物也减少，同时一些代谢产物不稳定，随着时间的推移也逐步分解。温度也是菌丝生长的一个重要因素，本研究发现，在适当低温(20 ℃)下有助于菌丝体的生长，菌丝干质量最大，但不利于产生有抑菌活性的次生代谢产物；而适当高温(最适温度为28 ℃)有助于次级代谢产物的产生，如在25～40 ℃时，T05发酵液的乙酸乙酯提取物都能更有效地抑制V.sordida的生长。表明菌丝生物量与发酵液的抑菌率在不同条件下不一致，不是都成正比关系。过酸或过碱的培养条件都不利于菌株的生长，同时也不利于菌株T05产生并积累次生抑菌活性物质，当pH=6时菌丝干质量达到最大，其对病原菌的抑菌率也最高；当pH≤4或pH≥10时，其对V.sordida的抑菌率均降到65%以下。接菌量对T05产生抑菌物质的影响也较为明显，把握好接菌量也可以更高效地得到抑菌活性物质。

本研究为深入研究木霉菌代谢产物提供了参考，同时也为研制和开发生物防治木霉制剂提供了基础理论依据。

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Parameter Screening of Antifungal Activity of Fermentation Liquid ofTrichodermalongibrachiatumT05//

Ji Hailong

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy); Chi Yujie(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：120-124.

Trichodermalongibrachiatum; Liquid fermentation; Antifungal activity; Parameter screening;Valsasordida(Cytosporachrysosperma)

吉海龙，男，1991年11月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail: 1156449598@qq.com。

池玉杰，东北林业大学林学院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

1)国家林业局科技成果推广项目([2004]57号);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD200901)。

责任编辑：程红。