生防长枝木霉菌培养特性及形态学与系统发育学鉴定1)

池玉杰　　　　　　　伊洪伟

(东北林业大学，哈尔滨，150040)　　　　(重庆市农业科学院果树研究所)



生防长枝木霉菌培养特性及形态学与系统发育学鉴定1)

池玉杰伊洪伟

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(重庆市农业科学院果树研究所)

采用宏观观察法和显微镜镜检的方法，在PDA和MEA培养基上对1株自我采集的具有生防价值的木霉菌株T05进行了培养特性和形态学研究。结果表明：该菌株在PDA平板培养基上生长较快，产分生孢子较早且多，也能产生厚垣孢子；在MEA上能产生分生孢子，但不产生厚垣孢子。该菌株产孢簇为松散羊毛状到紧实的疱状结构；分生孢子梗具有较简单的分枝系统，通常呈直角的1～2次分枝，单生或有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布，时常单生，安瓿形或柱形，基部常缩缢但不明显；分生孢子单细胞、长方形到椭圆形、绿色、光滑，大小为(2.0～3.0)μm×(2.0～6.0)μm。根据这些形态特征将菌株T05鉴定为长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)。在此基础上，对T05的rDNA转录间区序列ITS和翻译延伸因子基因tef1-α的第5内含子序列进行了扩增、测序。系统发育学的研究表明，该菌株的ITS序列和tef1-α的第5内含子序列与长枝木霉的多个菌株都具有最大的相似性，因此属于长枝木霉。

长枝木霉；培养特性；形态学；rDNA的转录间区序列；翻译延伸因子1-α亚基蛋白基因

We studied the cultural characteristics and morphology ofTrichodermastrain T05 on PDA and MEA media by using the method of macroscopical observation and microscopic examination. T05 grew fast on PDA plate, produced conidia early and much, and also produced chlamydospores, whereas, only produced conidia but not chlamydospores on MEA. The conidiophone tufts of T05 were from incompact floccose to compact bleb configuration. The conidiophones were with a simple branching system, usually with right-angled one to two time side branching which was single or paired. Phialides distributed irregularly on each side of the main axis, or secondary branches of conidiophores, often arising singly, ampulliform or cylindrical, usually only slightly attenuate at the base. Conidia were unicellular, oblong to narrowly ellipsoidal, green, smooth-walled, (2.0-3.0)μm×(2.0-6.0)μm. T05 was identified asT.longibrachiatumin sect.Longibrachiatumbased on its morphological characteristics. Then, ITS and partial gene sequence of translation factor 1-alpha (tef1-α) were amplified and sequenced, and aligned with the ITS andtef1-αsequences in GenBank of NCBI. The ITS andtef1-αsequences of T05 had the highest homology with many strains ofT.longibrachiatum, and T05 was also identified asT.longibrachiatumby molecular phylogenetic analysis.

木霉菌(Trichodermaspp.)是具有生物农药和生物肥料开发价值的一类真菌，其具有生长速度快、环境友好、广谱抗性的特点，以及对植物的促生作用。由于木霉对多种植物病害都具有良好的生物防治效果，已经成为生物防治和农林生产中广泛应用的真菌，但是，每种木霉在生防功能与代谢产物上都不尽相同，因此，准确的分类鉴定对其在农林生产中的应用具有重要的意义。在研究木霉菌株生防潜力之前必先清楚其分类地位，以免造成混淆以及在制剂生产过程中不必要的烦扰。

自1932年Weildling发现第1株木霉开始，木霉属的分类一直都存在着争议。直到1969年，Rifai[1]提出第1个木霉属的分类系统，该属的分类才渐趋于稳定和合理。从1984年到1991年，Bissett[2-5]在Rifai等的研究工作基础之上又对木霉属的分类进行了再次修订，除了Rifai确定的种之外，又添加了很多种，最终将木霉属分为5个组。对于木霉属真菌，由于较容易获得其快速生长的菌落，基于形态学特征的传统分类方法是必须的，其中分生孢子梗的分枝形式、小瓶梗的着生状态与形态、分生孢子的形态和大小是鉴定木霉的重要指标。但是，单一的形态学分类有时受到微观形态特征观察的限制，存在着不足，因为木霉菌株的外观形态特征多种多样，又缺乏一定的稳定性，易受环境影响而变化，不同种的形态往往又极其相似而难以区分，因此其属内种间分类鉴定长期处于混乱状态。近年来，人们已经将真菌形态学分类方法与分子生物学的系统发育分类鉴定方法相结合，双方互相佐证。木霉分子系统学的快速发展，为确定木霉属各种的分类地位提供了依据，可以准确地将木霉菌鉴定到种，同时也使木霉属增加了许多新的成员。分子生物学技术在木霉系统发育分类上的应用有多种，其中最为重要的是Kopchinskiy et al.[6]在NCBI BLAST的基础上开发了TrichoBLAST搜索工具(http://www.isth.info/tools/blast/index.php)，它是用于系统发育标记序列相似性研究的在线数据库，专门用于木霉属及其有性型肉座菌属(Hypocreaspp.)物种的序列比对分析和鉴定。其中含有rDNA转录间区序列ITS、翻译延伸因子1的α亚基蛋白基因tef1-α部分序列等木霉属与肉座菌属系统发育标记的数据信息。本研究对1株自我采集的具有潜在生物防治东北地区多种林木、果树皮部病害和农作物病害的木霉菌T05，进行了培养特性研究与形态学鉴定，并在此基础上，对该菌株的rDNA转录间区序列ITS和tef1-α的第5内含子序列进行了扩增、测序，并与NCBI数据库中的木霉菌种类进行比对，完成了该木霉菌的系统发育学鉴定。明确了该菌株的分类地位，目的为准确与深入细致地研究其生防机制、进行木霉生物制剂的生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌种来源和培养基

木霉菌株T05是2004年5月份笔者采自大庆市林业局红旗林场20年生小黑杨(Populussimonii×P.nigra)树林下的枯枝落叶，自行分离得到的1株木霉菌株。将已纯化的在PDA斜面上的菌种于冰箱中4 ℃保存在东北林业大学森林病虫病理实验室。

培养基：PDA(去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加水定容至1 L)；MEA(麦芽糖12.5 g，琼脂20.0 g，加水定容至1 L)。

1.2木霉菌株T05的培养特性

将在PDA平板上培养3～5 d已活化的T05菌株，用打孔器打直径5 mm的菌饼，分别接种到直径9 cm的PDA、MEA平板一端，放入培养箱内25 ℃恒温培养，直到所有菌落覆盖整个平板，每处理3个重复。培养特性的观察包括宏观和微观特征。宏观特征有生长速度，菌落生长新区的特征，菌落的颜色、结构和质地及其变化，培养基的颜色变化，培养物的气味等。微观特征有生长新区的菌丝体、气生菌丝体和基内生菌丝体的类型和分隔情况，无性孢子——厚垣孢子、分生孢子等的产生情况及特征等。

1.3木霉菌株T05的形态学鉴定

将在PDA平板上培养3～5 d的菌种，用打孔器打直径5 mm的菌饼接种到9 cm PDA平板的中心，在25 ℃下恒温培养，每12 h用十字交叉法测量菌落生长直径，观察菌落特征，待产孢后，先用光学显微镜观察，测量分生孢子大小、分生孢子梗主轴的宽度，获得分生孢子梗的分枝情况、分枝的角度和其他细微形态学特征，然后用Olympus摄影显微镜拍照。将所得木霉菌培养菌落的宏观与微观形态学特征汇总，采用Gams和Bissett的新分类系统[2-5，7]，根据美国农业部农研局系统真菌学和微生物学实验室建立的在线木霉分类鉴定系统网站(http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm)[6]，以及其它木霉分类方面的相关文献[8-9]，对该木霉菌株进行形态学的鉴定。

1.4木霉菌株T05的系统发育学鉴定

使用天根公司的DNAquick快捷型植物基因组DNA提取试剂盒，从T05快速生长的菌丝中提取基因组DNA，分别用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和大小，然后将DNA稀释到终质量浓度(100 mg·L-1)用于PCR反应。应用系统发育标记ITS序列的真菌通用引物SR6R(5′-AAGWAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和LR1(5′-GGTTGGTTTCTTTTCCT-3′)，扩增含有转录间区序列ITS1和ITS2、及5.8S与部分28 S rRNA基因的rDNA序列[10]，以及引物tef1fw(5′-GTGAGCGTGGTATCACCATCG-3′)和tef1rev(5′-GCCATCCTTGGAGACCAGC-3′)，扩增翻译延伸因子基因tef1-α的第5短内含子序列[11]。

将测得的ITS序列和tef1-α序列与GenBank中已有的序列进行BLAST，对获得的同源序列进行序列分析和菌种鉴定。采用TrichOKey v.2.0在线工具(www.isth.info/tools/molkey/)根据ITS序列进行菌种鉴定，用TrichoBLAST(www.isth.info/tools/blast/)对tef1上的短内含子进行最匹配菌种的搜索[12]。采用MEGA Version 4.0软件进行多序列比对，并运用NJ法构建长枝木霉菌系统发育树。

2　结果与分析

2.1木霉菌株T05在PDA和MEA培养基上的培养特性

在PDA培养基上的培养特性：菌落边缘均匀，毡状。初为白色，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状，1 d以后产生分生孢子的绿色同心环，间距为1.0 cm，非常清晰(图1a)。生长新区的产孢簇为白色，靠近老区的产孢簇一部分由白色渐变为绿色。接种点周围全部被绿色孢子覆盖。生长新区的菌丝简单分隔，分枝，直径1.0～4.5 μm。厚垣孢子顶生或间生，圆形或椭圆形，大小为(4.0～6.5)μm×(4.0～12.5)μm。气生菌丝简单分隔，分枝，直径1.0～4.5 μm；分生孢子单细胞、椭圆形、绿色，大小为(2.0～3.0)μm×(2.0～6.0)μm。基内生菌丝简单分隔，分枝，直径1.5～6.5 μm，多弯曲，内含物丰富；厚垣孢子圆形，大小为(4.0～5.5)μm×(4.0～5.5)μm。

在MEA培养基上的培养特性：菌落边缘均匀，紧贴生。初为白色，后变绿色，具较清晰但狭窄的产孢簇同心环纹，间距0.5 cm(图1b)。气生菌丝体稀疏。生长新区的菌丝简单分隔，简单分枝，直径1.0～4.5 μm。分生孢子单细胞、椭圆形、绿色，大小为(2.0～3.0)μm×(2.0～6.0)μm。基内生菌丝简单分隔，简单分枝，内含物丰富，直径1.0～4.5 μm。

2.2木霉菌株T05的形态学特征与鉴定

菌落生长快，接种点在中心时2～3 d内覆盖直径9 cm的PDA平板。菌落初为白色，最终为绿色，产孢区形成明显的同心圆环(图1c)，反面变黄(图1d)。气生菌丝发达，蛛网状。分生孢子在产孢簇形成，产孢簇为松散羊毛状到紧实的疱状结构(图2a)。分生孢子梗主轴具有较简单的次级分枝系统，主轴宽2.0～3.0 μm，通常具有呈直角的1～2次分枝，单生或有时成对，常不规则(图2b)。瓶梗不规则地在侧面分布，时常单生，安瓿形或柱形，略呈弯曲状，基部常缩缢但不明显(图2b)。分生孢子单细胞、长方形到椭圆形、绿色、光滑，大小为(2.0～3.0)μm×(2.0～6.0)μm(图2c)。

以上特征与长枝木霉相似，因此，将木霉菌株T05鉴定为Longibrachiatum组的长枝木霉菌(T.longibrachiatum)。

a、b.分别在PDA与MEA培养基上一侧接种3 d与5 d后的形态，分生孢子以同心环的形式产生；c、d.在PDA培养基上中心接种7 d后平板正面和反面的形态与颜色。

图1木霉菌株T05的宏观培养特性和形态学特征

a.产孢簇(物镜4×)；b.分生孢子梗(物镜60×)；c.分生孢子(物镜60×)。

2.3木霉菌株T05的ITS和tef1序列与系统发育

用引物SR6R和LR1从菌株T05菌丝DNA中扩增出的ITS目的片段为639 bp(NCBI accession number：EU769111)，其中1～26 bp为18S rDNA的部分序列，27～249 bp为ITS1，250～407 bp为5.8S rDNA，408～576 bp为ITS2，577～639 bp为28S rDNA部分序列。菌株T05获得的ITS序列与NCBI GenBank中所有的ITS寡核苷酸条形码(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对的结果表明，T05和木霉属的亲缘关系密切，这一序列与99个木霉菌株的ITS序列覆盖度为93%～99%，相似性在98%以上；和其中的62个长枝木霉菌株(T.longibrachiatum/H.orientalis)的覆盖度为94%～99%，相似性都高达99%以上。因此，将菌株T05鉴定为长枝木霉。在TrichOKey v.2.0(www.isth.info/tools/molkey/)上与其中的ITS1和ITS2寡核苷酸条形码比对鉴定的结果表明，这一菌株为长枝木霉(图3)。

用引物tef1fw和tef1rev从菌株T05菌丝DNA中扩增出的tef1-α目的片段为228 bp(NCBI accession number：EU839839)，获得的该tef1-α序列通过TrichoMARK鉴定出其中含有tef1-α第5内含子及其左右一部分外显子的基因片断，其中1～42为第5外显子序列的一部分，43～106为第5内含子序列，107～228为第6外显子序列的一部分。该序列与NCBI GenBank中已知的tef1序列比对的结果表明，这一序列与88个长枝木霉菌株的该序列最相近，覆盖度86%～98%，相似性92%～98%。最高分值范围在284～369(分值表示两序列的同源性，分值越高表明它们之间相似的程度越大)，E值在4e-73～1e-98之间(从大到小。E值是分值可靠性的评价，它表明在随机的情况下，其它序列与目标序列相似度要大于分值的可能性，所以E值越低越好)。与菌株T.longibrachiatumPP 105的tef1序列(HM450971)有最高的分值(369)和最小的E值(1e-98)。说明菌株T05与长枝木霉亲缘关系最近，因此，根据tef1-α序列也将菌株T05鉴定为长枝木霉。

图3　木霉菌株T05的ITS序列在TrichOKey 2.0上的鉴定结果

3　结论与讨论

对木霉菌株T05培养特性的研究结果表明，该菌株在PDA平板上生长很快，气生菌丝体较繁茂，分生孢子产生较早且多，很快形成厚实的产孢簇，并且在培养基内和生长新区的菌丝中能产生较多的厚垣孢子；而在MEA培养基上只产生分生孢子，不形成厚垣孢子，气生菌丝体稀疏，表现出生长不良。在这2种培养基上基内生菌丝内含物都比气生菌丝体丰富。对培养特性的研究，有助于全面把握菌株在培养过程中的重要形态，从而发现一些对实际应用有意义的特征。可以看出产孢量和产生孢子的类型与培养基的选择有关，这对于在制剂生产上获得较多种类的孢子和大量获得孢子有指导意义。

木霉属作为重要的生防菌，在植物病害的防治上发挥了巨大的作用，因此，确定其正确的分类地位，意义非常重大。以前一些生防制剂采用的菌种具体的分类地位经常混淆。Druzhinina et al.[12]认为木霉研究的最大障碍之一就是工业、植物病害生物防治、生态调查中使用不正确或易混淆的菌种名，从而使结果的比较变得值得商榷。对于木霉的形态学鉴定，Bissett[2-5]和Gams & Bissett[7]提出了一套新的分类体系，先将木霉属分成5个组：Hypocreaum组、Longibrachiatum组、Saturnisporum组、Pachybasium组和Trichoderma组，在此基础上，美国农业部农研局系统真菌学和微生物学实验室建

立了在线的木霉分类鉴定网站。本试验首先根据菌株T05的产孢簇从松散羊毛状到紧实的疱状结构，分生孢子梗的主轴长，着生短的二次分枝、三次分枝少，分枝和瓶梗常常单生等特点，将其划入长枝Longibrachiatum组，然后根据其安瓿形瓶梗基部常缩缢但不明显，以及分生孢子等形态学特征将其鉴定为长枝木霉。对于木霉的系统发育学鉴定，2种系统发育标记即2种寡核苷酸条形码，rDNA的转录间区ITS序列和翻译延伸因子1-α亚基蛋白基因tef1-α的部分序列，是强有力的鉴定工具，与形态学分类构成有益的互补。ITS序列(ITS1、5.8S和ITS2)既具保守性，又在科、属、种水平上具有特异性，一直被用于真菌的系统发育研究；基因tef1-α是编码翻译延伸因子1-α亚基蛋白的基因，包括3个系统发育标记，分别是第4、第5内含子和第6外显子，这3个标记能够不同程度地区分物种[12]。本试验根据这2种系统发育标记，将菌株T05都鉴定为长枝木霉。形态学的鉴定结果与系统发育的鉴定结果完全相同。

木霉属中哈茨木霉(T.harzianum)、深绿木霉(T.atroviride)、绿色木霉(T.viride)等都是著名的生物防治菌种。本试验中的长枝木霉菌株T05具有耐低温的特点，能防治林木皮部病害、作物病害，是生防木霉属真菌中的一种。该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC No.2888)，并已经获得国家发明专利(专利号：ZL200910072978.8)，其作为生防木霉菌株新的一员，有待进一步开发应用。

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Culture Characteristics and Morphological and Phylogenetic Identification ofTrichodermalongibrachiatumT05//

Chi Yujie

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：103-106,119.

Trichodermalongibrachiatum; Cultural characteristics; Morphology; ITS; Translation factor 1-alpha (tef1-α)

池玉杰，女，1964年4月生，东北林业大学林学院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

1)国家林业局科技成果推广项目([2004]57号);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD200901)。

责任编辑：程红。