芹菜素诱导膀胱癌5637细胞凋亡的机制研究

谢杨春 邓永诚 田黎

【摘 要】 目的：研究芹菜素诱导人膀胱癌5637细胞凋亡的作用机制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素处理膀胱癌5637细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；采用Western blotting检测细胞凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和PARP蛋白的表达水平。结果：芹菜素处理使细胞Bcl-2蛋白表达降低且呈浓度依赖性，并使Bax的表达增加和导致PARP蛋白发生切割且呈浓度依赖性。结论：芹菜素能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Bcl-2并上调Bax表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有关。

【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞凋亡；机制

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）14-0025-04

Abstract：Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. The expressions of apoptosis-related proteins Bax， Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting. Results Apigenin causes concentration -dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression， enhancing PARP cleavage， downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Apoptosis； Mechanism

膀胱癌的全球发病率在全身恶性肿瘤中占第9位。而在我国，膀胱癌是泌尿系统中最高发的一种恶性肿瘤。临床上根据分期可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌[1]。其中非肌层浸润性膀胱癌占发病率70%，其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tumor， TUR-Bt）加术后膀胱灌注化疗，膀胱灌注化疗常用药物包括表柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羟基喜树碱等[2]，虽经过严格术后灌注方案，仍有20%左右的肿瘤患者术后仍会复发。而肌层浸润性膀胱癌中有一部分患者的治疗主要需采用以顺铂为主的化疗方案[3]，顺铂的化疗方案疗效虽然敏感，但不能持久，患者5年生存率仅为20%～40%。而且，目前常用的化疗药物存在不同程度的全身或局部毒副反应，包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。这些方法虽然在一定程度上取得一定的疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[4]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮），是一种广泛存在于果蔬中的一种黄酮类化合物，具有多种药理活性[5-6]，其中以抗肿瘤活性研究较多。研究表明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡，包括：人胃癌细胞[7]、人卵巢癌[8]、人结肠癌细胞[9]、人乳腺癌MDA-MB-231细胞[10]、人肝癌Hep G2细胞[11]、HeLa细胞[12]等，而其对膀胱癌细胞的作用机制研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用，探讨其促进细胞凋亡的作用机制。

1 实验材料

1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；RPMI1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；人抗兔Bax，Bcl-2，PARP抗体购自Santa Cruz，GAPDH抗体购自Abcam，BCA蛋白定量试剂盒和羊抗兔/鼠二抗购自Pierce；PVDF膜Millipore；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

2 实验方法

2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别加入100μL不同浓度的芹菜素（25、50、75和100μmol/L），每个浓度设4个重复，同时设立空白对照组（加同体积的DMSO），细胞培养72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L的MTT后继续培养4h，弃上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解结晶紫，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将5637细胞以2×106/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（50、75、100μmol/L），处理24h后收集细胞，并调整细胞数至1×106/mL，用预冷PBS 洗涤细胞2次，弃上清液。加入100μL染料结合缓冲液重悬后，加入10μL AnnexinV-FITC 染色，混匀后室温避光静置15min，然后加入200μL的染料结合缓冲液和5μL PI染液（50mg/L），静置5min，立即进行流式细胞仪分析。

2.3 Western blotting检测Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，以75、100μmol/L芹菜素作用细胞24h后，收集细胞，在每管细胞中加入100μL的蛋白裂解液后，BCA法进行总蛋白定量，每泳道上样量为40μg总蛋白，经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上。一抗稀释浓度分别为：Bax（1∶3000）、Bcl- 2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗为1∶5000稀释。ECL化学发光液，X光片暗室曝光、显影及定影。采用WO-9413B型凝胶成像。实验重复3次。

2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间差异显著性比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 为了研究芹菜素对膀胱癌细胞增值的作用，采用不同浓度芹菜素（25、50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞48 h后，采用MTT法检测各个组细胞增值效率，研究结果显示，不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比具有显著性差异（P< 0.05，图1）。芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（25、50、75和100μmol/L）芹菜素处理后，随着处理浓度的增加，其抑制效果更明显。芹菜素对5637细胞的抑制呈现浓度依赖的特征。

3.2 Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测芹菜素诱导5637细胞的凋亡率为了研究芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用，根据MTT实验结果，采用不同浓度芹菜素（50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24 h后，采用Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测各个组细胞的凋亡效率，研究结果显示（图2和图3），0、50、75和100 μmol/L芹菜素处理组细胞凋亡率分别为（2.3±0.8）%、（14.3±2.9）%、（20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，与对照组相比差异显著（P<0.05）。随着芹菜素处理浓度的增加，其诱导膀胱癌5637细胞凋亡效率效果更明显，提示芹菜素对5637细胞的凋亡诱导效应具有剂量依赖性。

3.3 芹菜素对Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达的影响 为了探讨芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用机制，采用不同浓度芹菜素（75和100 μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24h后，采用Western-blotting检测各个组细胞的凋亡相关蛋白的表达，研究结果显示，75和100μmol/L芹菜素芹菜素处理5637细胞24h后，进行蛋白检测。检测结果表明，随着浓度增加，Bax蛋白表达逐渐增加，PARP蛋白的切割水解亦逐渐增加，而Bcl-2蛋白表达逐渐降低，因此Bcl-2/Bax比值逐渐下降（图4）。随着芹菜素处理浓度的增加，膀胱癌5637细胞中，Bcl-2与剪切的PARP蛋白表达量逐渐降低，Bax蛋白表达量逐渐增高，结合以上实验结果，提示芹菜素对5637细胞的凋亡可能是通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达，激活PARP的活性，从而诱导5637细胞的凋亡，并且这种诱导效应具有剂量依赖性。

4 讨论

芹菜素是具有多种生物活性的黄酮类化合物，多项研究结果已经证实， 芹菜素对体内、外多种癌细胞具有杀伤作用， 其作用机制可能是通过对细胞凋亡的基因调控实现的，主要通过如Rb、p53及周期蛋白依赖性激酶抑制因子如p15、p16、p21等[13]。抗癌活性是芹菜素的主要活性之一， 细胞凋亡是基因调控细胞程序性死亡的过程， 凋亡异常与肿瘤发生发展有密切关系。细胞凋亡敏感性主要取决于于多种凋亡相关基因表达产物的水平及相互作用， 存在着多种控制细胞凋亡的复杂的调控系统。

体内肿瘤细胞生长主要是由于对机体正常调控机制的逃逸来实现的， 细胞正常的凋亡调控机制受到严格的控制。对多种肿瘤细胞株， 芹菜素以浓度及时间依赖性的方式诱导出现细胞皱缩、染色体凝集及DNA碎裂等特征性凋亡检测标志。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本研究采用Annexin-V荧光与PI双染色技术在5637细胞中也获得同样结论。芹菜素能抑制人膀胱癌5637细胞生长， 诱发细胞凋亡。

Bcl-2和Bax基因家族在细胞凋亡过程中起着重要的调节作用[14]，Bcl-2和Bax蛋白之间的比例影响着细胞对各种凋亡诱导分子的敏感性，直接决定下游Caspases活化与否，从而决定凋亡是否发生。PARP正是Caspase的切割底物，切割过的PARP不能正常发挥功能，引起DNA的断裂[15]。PARP切割降解是细胞凋亡的标志之一。通过Western blotting 检测发现75、100μmol/L芹菜素处理后，PARP的切割增加，并且这种增加是浓度依赖性的。Bcl-2表达量多，细胞易于存活，而当Bax表达量过多时，容易形成Bax同源二聚体，导致细胞容易发生凋亡。通过Western blotting 检测发现75、100 μmol/L芹菜素可降低Bcl-2蛋白的表达，同时增加Bax的表达，且随着浓度的增加增加/抑制的效果更加明显。实验结果显示芹菜素诱导膀胱癌5637细胞凋亡的机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，从而诱导细胞凋亡。

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（收稿日期：2016.05.03）