舍他康唑对常见临床分离念珠菌属菌株的体外抗菌活性研究

王千　吴伟伟　张浩　万喆　李若瑜　王爱平　刘伟

(北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034)



舍他康唑对常见临床分离念珠菌属菌株的体外抗菌活性研究

王千吴伟伟张浩万喆李若瑜王爱平刘伟

(北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034)

目的了解舍他康唑对常见临床分离念珠菌属菌株的体外抗菌活性。方法参照美国临床和实验室标准协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的M27-A3方案测定舍他康唑对112株念珠菌的MIC值。结果 舍他康唑对112株念珠菌在24 h的MIC GM为0.18 μg/mL，MIC范围为≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分别为0.125 μg/mL、1 μg/mL。对念珠菌属各菌种的MIC GM从低到高依次为白念珠菌0.08 μg/mL，光滑念珠菌0.158 μg/mL，近平滑念珠菌0.318 μg/mL，热带念珠菌为0.425 μg/mL,克柔念珠菌为1.414 μg/mL。结论舍他康唑对常见临床分离念珠菌属菌株均有较好的体外抗菌活性。

舍他康唑；念珠菌属；体外；敏感性试验

[Chin J Mycol，2016，11(3):153-155]

舍他康唑是一种新型咪唑类抗真菌药物，具有广谱抗菌活性，能够有效抑制皮肤癣菌、念珠菌、帚霉及革兰阳性菌，并且还有良好的抗炎活性[1]。国内目前已有使用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准化方法检测舍他康唑对皮肤癣菌体外抗菌活性的报道[2]，但缺乏该方法测定舍他康唑对念珠菌的体外抗菌活性的数据。为了解舍他康唑对我国临床常见致病性念珠菌的体外抗菌活性，本研究参照CLSI制定的M27-A3 (酵母菌)微量液基稀释法测定了舍他康唑对分离自我国的112株念珠菌的体外抗菌活性。部分内容已在2015年5月澳大利亚墨尔本举办的第19届国际人与动物真菌大会 (19thcongress of the International Society for Human and animal Mycology)上进行了交流。

1　材料与方法

1.1受试菌

受试菌株来自于北京大学真菌和真菌病研究中心保藏菌株，试验用菌株均为临床分离株。念珠菌菌株均采用ChroMagarCandida琼脂显色培养基及API 20CAUX酵母鉴定系统鉴定。共112株，其中白念珠菌40株、光滑念珠菌28株、近平滑念珠菌23株、热带念珠菌17株、克柔念珠菌4株。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2受试药物

硝酸舍他康唑纯品由西班牙Ferrer Interquim,S.A提供。编码：6191065；批号：A14405A；生产日期：2014年7月；分析日期：2014年8月27日。

1.3体外抗菌活性测定[3]

培养基制备按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液体培养基，以终浓度为0.165 mol/L的MOPS为缓冲液，调整培养基在25℃时pH值为7.10±0.1。

药物溶液的制备称取舍他康唑的药粉溶解在DMSO (二甲基亚砜)中制成浓度1 600 μg/mL的药物原液，药物储存液于-80℃保存备用。

药敏板配置用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍于药物的终浓度 (范围为0.031～16 μg/mL)。取0.1 mL各浓度药液分别加入96孔细胞培养板第1到第10列各孔，取0.1 mL不含药物的培养基加入第11列作为生长对照 (阳性对照)，取0.2 mL培养基加入第12列作为阴性对照。配制好的药敏板储存在-20℃备用。

菌悬液制备和接种受试菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar，PDA)培养基上35℃培养24～48 h。用无菌棉签蘸取菌落溶于生理盐水中，混匀后调整菌悬液浓度至0.5麦氏单位，对应孢子浓度为 (1～5)×106CFU/mL，将此菌悬液用RPMI-1640先稀释20倍，再稀释50倍得到2倍终浓度菌悬液。将配置好的药敏板取出室温下融化，96孔培养板除12列外，其余各孔均加入100 μL菌悬液，将培养板置于35℃恒温培养。

孵育及结果判读将接种后的药敏板于35℃条件下孵育，分别在24 h和48 h读取最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。舍他康唑的MIC定义参考其他唑类药物，即与生长对照相比，真菌生长50%受抑制孔中的最低药物浓度。由于M27-A3方案中没有规定舍他康唑的判读时间，参照该方案中检测三唑类药物对念珠菌的抗菌活性时的规定，若24 h生长对照生长良好，则选取24 h MIC为标准，若生长不完全，则延长至48 h读取结果。故以24 h孵育时间为标准，但是，为与国内外同行的结果进行比较，将24 h和48 h的结果都进行了记录。

1.4统计学方法

采用SPSS Version 21进行统计学分析，得到MIC范围、MIC几何均数 (geometric mean，GM)、MIC50和MIC90。

2　结　　果

舍他康唑对112株念珠菌在不同时间点各个菌种的MIC范围及GM结果见表1。

表1舍他康唑对112株念珠菌在24 h和48 h各个菌种的MIC及GM (μg/mL)

Tab.1MIC & GM values of sertaconazole against 112 ofCandidaspp.at 24 hour and 48 hour

菌株(株数)孵育时间MIC范围MIC50MIC90GM白念珠菌(40)24h≤0.03～20.060.250.08048h≤0.03～40.12510.216光滑念珠菌(28)24h0.03～20.1250.50.15848h0.25～20.510.725近平滑念珠菌(23)24h0.125～160.250.50.31848h0.125～160.510.599热带念珠菌(17)24h0.125～20.2510.42548h0.25～20.520.722克柔念珠菌(4)24h1～2121.41448h1～4141.682合计(112)24h≤0.03～160.12510.18048h≤0.03～160.520.466

在24 h，舍他康唑对念珠菌的MIC GM为0.18 μg/mL，MIC范围为≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分别为0.125 μg/mL、1 μg/mL。对白念珠菌的GM为0.08 μg/mL，对光滑念珠菌为0.158 μg/mL，对近平滑念珠菌为0.318 μg/mL，对热带念珠菌为0.425 μg/mL，对克柔念珠菌为1.414 μg/mL。

在48 h，舍他康唑对念珠菌的MIC GM为0.466 μg/mL，MIC范围为≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分别为0.5 μg/mL、2 μg/mL。对白念珠菌的GM为0.216 μg/mL，对光滑念珠菌为0.725 μg/mL，对近平滑念珠菌为0.599 μg/mL，对热带念珠菌为0.722 μg/mL，对克柔念珠菌为1.682 μg/mL。

在试验中观察到舍他康唑不能完全抑制念珠菌的生长，存在拖尾现象，并且孵育时间对MIC有明显影响，48 h的MIC显著高于24 h的MIC，GM升高了2.6倍，尤其对光滑念珠菌，48 h的GM相比24 h的GM升高了5倍。

另外，舍他康唑对氟康唑耐药的白念珠菌及光滑念珠菌的MIC结果显示，3株氟康唑耐药 (MIC≥8 μg/mL)的白念珠菌的MIC范围是0.03～2 μg/mL，GM为0.391 μg/mL。2株氟康唑耐药 (MIC≥64 μg/mL)的光滑念珠菌MIC范围是1～2 μg/mL，GM为1.414 μg/mL。2株氟康唑耐药 (MIC≥8 μg/mL)的近平滑念珠菌，1株对舍他康唑同样耐药，另1株的MIC为0.125 μg/mL。

3　讨　　论

舍他康唑属于咪唑类抗真菌药，具有抑菌和杀菌双重作用机制。主要通过抑制真菌细胞色素P450依赖酶—羊毛固醇14α-去甲基化酶发挥作用，一方面阻断真菌细胞膜麦角固醇的生物合成，导致膜麦角固醇缺乏；另一方面甲基化的羊毛固醇在真菌细胞内积聚，真菌细胞生长受到抑制或者死亡。此外，舍他康唑在高浓度时可以直接结合到细胞膜中，从而导致细胞内容物外流，引起真菌细胞的死亡[4]。

舍他康唑具有广谱抗菌活性，对皮肤癣菌、念珠菌、隐球菌、马拉色菌、曲霉、赛多孢霉和帚霉均有抗菌活性，尤其对皮肤癣菌和念珠菌抗菌活性最强。国外有关舍他康唑对念珠菌属体外抗菌活性的研究大多是在CLSI抗真菌药敏标准方案发布之前进行的。试验方法多种多样，包括微量液基稀释法、纸片扩散法、琼脂稀释扩散法。并且试验时使用的培养基、孵育时间及结果判读标准也都不尽相同。

Carrillo等[5]采用改良沙氏培养基微量稀释法检测舍他康唑等对150株念珠菌的体外抗菌活性，舍他康唑的抗菌活性优于益康唑及联苯苄唑，近平滑念珠菌对舍他康唑最敏感，热带念珠菌对其最不敏感。Carrillo等[6]采用纸片扩散法检测了来自阴道和皮肤的酵母菌 (183株)对10种抗真菌药物的敏感性，结果显示舍他康唑对酵母菌的敏感率为87.4%，仅1株菌耐药 (0.5%)。此外，对舍他康唑敏感的酵母菌中包括10株氟康唑耐药菌及1株伊曲康唑耐药菌。Palacin[7]采用琼脂扩散法检测舍他康唑对分离自阴道的酵母菌 (94株)中的白念珠菌的MIC90为0.06 μg/mL,对光滑念珠菌和近平滑念珠菌均为0.25 μg/mL,对克柔念珠菌为1 μg/mL,对热带念珠菌为2 μg/mL。与氟康唑、酮康唑、芬替康唑、克霉唑和伊曲康唑相比，舍他康唑是抗菌活性较好的药物，尤其对光滑念珠菌效果最好。这些结果表明，舍他康唑对念珠菌属有较好的体外抗菌活性，优于益康唑、联苯苄唑、氟康唑、酮康唑等常用的局部抗真菌药物。然而，由于试验方法不统一，所以不同实验室的结果可比性较差。

Carrillo等[8]采用CLSI微量液基稀释法对100株分离自甲的临床分离株进行体外抗菌活性检测，结果显示舍他康唑对念珠菌属的MIC的GM分别为克柔念珠菌0.03 μg/mL、白念珠菌0.153 μg/mL、近平滑念珠菌0.27 μg/mL、光滑念珠菌0.63 μg/mL、热带念珠菌1.41 μg/mL。该研究并未明确指出孵育时间，其药敏数据与本研究48 h的结果相近，但克柔念珠菌的MIC明显低于我们的MIC值，双方所使用的克柔念珠菌的个数都比较少，可能是由于菌株本身的差异所致。

本研究在国内首次使用CLSI标准化药敏方案检测舍他康唑对常见念珠菌属的体外抗菌活性，结果显示舍他康唑对分离自中国的常见念珠菌属的菌株有良好的体外抗菌活性。

[2]万喆,王爱平,陈伟,等.6种抗真菌药物对皮肤癣菌体外抗真菌活性评价[J].中国真菌学杂志,2009，4(4):211-213.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved Standard—Third Edition.CLSI document M27-A3[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

[4]王爱平,李若瑜.抗真菌药物舍他康唑[J].中国真菌学杂志,2011，6(1):61-64.

[5]Carrillo-Munoz AJ,Torres-Rodriguez JM.Invitroantifungal activity of sertaconazole,econazole,and bifonazole againstCandidaspp[J].J Antimicrob Chemother，1995,36(4):713-716.

[7]Palacín C,Tarragó C,Agut J,et al.Invitroactivity of sertaconazole,fluconazole,ketoconazole,fenticonazole,clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginal yeast isolates[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2001,23(2):61-64.

Invitroantifungal activity of sertaconazole against clinical isolates ofCandidaspp.

WANG Qian，WU Wei-wei，ZHANG Hao，WAN Zhe，LI Ruo-yu，WANG Ai-ping，LIU Wei

(Desect1mentofDermatology&Venereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisonDermatoses,PekingUniversity,Beijing100034)

ObjectiveTo investigate theinvitroantifungal activity of sertaconazole against the clinical strains ofCandidaspp.isolated from China.MethodsMinimal inhibitory concentration (MIC) of sertaconazole against 112 strains were tested by using CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)broth microdilution method M27-A3.ResultsThe overall geometric mean 24 h MIC of sertaconazole was 0.18 μg/mL with a MIC range of ≤0.03～16 μg/mL,MIC50and MIC90of sertaconazole were 0.125 μg/mL,1 μg/mL,respectively.In the same time,the geometric mean MIC was 0.080 μg/mL forC.albicans,0.158 μg/mL forC.glabrata,0.318 μg/mL forC.parapsilosis,0.425 μg/mL forC.tropicalis,1.414 μg/mL forC.krusei.ConclusionSertaconazole is active against pathogenicCandidaspp..

sertaconazole;Candidaspp.；invitro；susceptibility tests

2015-05-29[本文编辑]施慧

中国中西医结合学会--皮肤病研究基金；国家自然科学基金 (81471925)

王千，女 (汉族)，博士研究生在读.E-mail:a13934240453@163.com

刘伟，E-mail:liuwei@bjmu.edu.cn;王爱平，E-mail:wangap@medmail.com.cn

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0153-03