α-熊果苷的研究进展

孙雷，姚德立 ，姚德坤，吴海龙

(1.大兴安岭林格贝寒带生物科技股份有限公司，黑龙江 大兴安岭 165012；2.黑龙江省寒带森林植物生物工程技术中心，黑龙江 大兴安岭 165012)

α-熊果苷的研究进展

孙雷1,2，姚德立1,2，姚德坤1*，吴海龙1,2

(1.大兴安岭林格贝寒带生物科技股份有限公司，黑龙江 大兴安岭 165012；2.黑龙江省寒带森林植物生物工程技术中心，黑龙江 大兴安岭 165012)

摘要：通过研究α-熊果苷的衍生物的来源极其制备方法、α-熊果苷的美白作用机制、化妆品处方中的作用原理，较为全面的综述了α-熊果苷开发情况和研究进展。其中包括α-熊果苷的皮肤美白作用，工业化生产α-熊果苷所采用的方法。最后，α-熊果苷作为目前较好的、高效的、安全的美白剂， 具有广阔市场应用前景。

关键词：α-熊果苷;制备;安全性

熊果苷[1]是从多种不同植物中提取得到的天然活性物质，是葡萄糖基化的氢醌衍生物，化合物分类中属于氢醌葡萄糖苷类，具有某些特定的生理功能，广泛存在于在动物、植物及微生物细胞中。熊果苷的分子结构中具有两种结构性、功能性官能团:一是，葡萄糖残基;二是，酚羟基。因此，熊果苷美白原理在于葡萄糖残基具有亲水性，酚羟基具有抑制黑色素合成酶的作用，故其作为起到美白作用的美白添加剂，加入到美白类化妆品中，可在一定程度上起到保湿美白的功效[2-4]。熊果苷物理状态呈现白色至浅灰色粉末状，较易溶于水和乙醇中，其具有两种异构体，即:α-熊果苷和β-熊果苷。二者均属于天然产物，前者主要通过植物提取或化学法合成得到;而α-熊果苷除通过植物提取制备外，主要通过微生物发酵法或称为生物转化法得到。研究表明，不仅在美白功效方面α-熊果苷远远强于β-熊果苷，而且在使用的安全性上α-熊果苷也远远优于β-熊果苷[5]。而且随着对α-熊果苷研究的一步步深入，如今在市场上常见添加α-熊果苷作为美白剂这一活性成分于具有美白功效的化妆品中，并且这样的产品也越来越多，因此就市场发展前景来看，α-熊果苷是十分具有市场前景的。

1 α-熊果苷来源及制备研究现状

α-熊果苷和β-熊果苷的来源完全不同，其一般制备β-熊果苷的方法包括植物提取、植物细胞培养和人工合成三种。而α-熊果苷一般通过不同的微生物转化法和酶合成法来进行制备，其中酶合成的原理是一分子葡萄糖和一分子氢醌结合形成单一的α-熊果苷[6]，其制备方法可分为下述的几个类别。

1.1 植物细胞组织作为生物反应器转化合成熊果苷

首先，微生物转化法根据反应原理可划分为两种方法，一种方法是利用生物体内的糖基化酶将外源的对苯二酚转化为熊果苷，该方法具有反应收率较高，同时立体选择性较好的特点。利用植物细胞组织作为特殊的生物反应器，在植物细胞组织中转化合成熊果苷，这类合成方法的关键在于植物组织生物反应器所需的培养液的成分配比和转化合成α-熊果苷的条件的选择。对于葡萄糖氢醌的转化率来说，不同种类的植物组织，不同培养液的成分配比对其影响均很大。Jahodar等人采用自动操作系统在计算机辅助进样的条件下，通过实验比较星叶梅、红景天、金洋花等5种植物培养液中熊果苷的浓度，研究植物组织作为生物反应器，不同植物组织培养液条件下，制备熊果苷的较佳工艺条件，以及植物组织反应器消耗葡萄糖氢醌的动力学特征。研究人员发现在植物组织培养开始的20 h期间，有的植物组织培养液的糖基转化能力较强，而在培养时间超过48 h后，对培养液中氢醌的转化率最高的为金洋花和红景天，其转化率达到90%以上，此时植物组织培养液中转化产生熊果苷的浓度也最高[7]。熊果苷还可以在β-糖苷酶催化条件下由对苯二酚和葡萄糖转化合成得到，1991年，Inomate 等人首次将对苯二酚加入到长春花植物组织细胞悬浮液中，通过对苯二酚的转化制得具有高含量的熊果苷; 此后Yokoyama 等人不仅采用更换新鲜的植物组织培养液的方法提高熊果苷产率，还通过在培养液中添加抗氧化剂方法是熊果苷的产率得到大大的提高[8-9]。1993 年，Noguchi 等通过改进植物组织培养的方法，以更高的产率得到更高含量的α-熊果苷[10]。综上所述，熊果苷的制备方法中，植物组织培养法及植物细胞作为反应器的酶转化法所需反应原料简单易得，反应过程无污染，即使某些反应条件的选择并不成熟，但具有广阔的发展前景，因此，引来众多国内外学者对这一课题升入研究。除利用长春花作为反应底物外，1998 年，Casas 等利用白曼陀罗毛状根作为植物细胞反应器，通过多因素水平正交试验确定合成熊果苷的较佳反应条件，当植物组织培养液中对苯二酚浓度为20～40 mg/L时，α-熊果苷的转化率最高[11]，对细胞损害最小。2001 年，赵明强等利用人参毛状根为载体合成α-熊果苷。该方法首先将人参毛状根细胞培养 22d，更换培养基后再加入对苯二酚，继续培养24 h，α-熊果苷转化率可达 89%[12]。2007 年，严春艳等将何首乌毛状根作为植物组织反应器进行了熊果苷的转化合成，在研究过程中将培养时间、底物浓度和培养容器体积作为单因素对熊果苷转化率的影响进行研究，结果表明，培养时间为72 h，底物对苯二酚的浓度为 1100 mg/L，熊果苷的转化率最高，达到81.45%，并且对该方法的扩大规模生产工艺的确定也取得初步成功[13]。近几年，合成α-熊果苷的方法得到巨大改进。2015年，赵如奎[14]等以对苯二酚和麦芽糊精为底物，通过 α-环糊精葡萄糖基转移酶和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应体系催化合成 α-熊果苷。较佳的合成条件为: 以葡萄糖当量的8%～10% 的麦芽糊精作为供体底物，麦芽糊精与对苯二酚浓度分别为60 g/L、150 mmol/L，缓冲液 pH 值为6.0，在温度为40 ℃ 条件下反应 24 h。在此反应条件下，α-熊果苷的产量为 3.17 g/L，对苯二酚转化率为 7.77% 。

1.2 微生物代谢的酶催化合成熊果苷

其次，熊果苷的生物转化法分为两种，除上述植物细胞培养液作为反应器的方法外，其另一种方法是利用微生物细胞作为反应器，通过转化法合成α-熊果苷，该方法主要是将葡萄糖和氢醌通过不同微生物代谢酶催化，具有选择性地生物合成α-熊果苷。

2005年，刘春巧[15]等将嗜麦芽黄单胞菌BT-112作为生物反应器，向培养液中加入氢醌和葡萄糖，该反应生成的α-熊果苷的转化率相对于反应物氢醌而言高达91.2%。此后，王秀捧[16]等将该转化反应中初始加入的氢醌浓度、反应温度以及葡萄糖与氢醌的摩尔比、磷酸缓冲溶液 pH 值、反应时间等条件进行工艺优化，得到制备α-熊果苷较佳的微生物培养条件:氢醌的初始浓度为 30 mmol/L，葡萄糖和对苯二酚的物质量比为 1∶20，磷酸缓冲溶液 pH 值为 8.0时，在 25℃下反应45 h后，得到α-熊果苷的浓度为 85 g/L，在上述反应条件下α- 熊果苷的转化率可达86.7%。该方法为α-熊果苷的工业化生产提供了具有参考价值的理论基础，但同时也存在一些反应中微生物细胞对氢醌不具有耐受性、整体反应时间也较长的问题。对此，韦祎[17]等将离子型表面活性剂加入到该组织培养液中，通过表面活性剂的亲水疏水作用于微生物细胞膜，从而改变其选择透过性，使微生物细胞内外物质交换加快，提高了微生物细胞对氢醌的耐受性的同时也大大缩短了反应时间。2011年，李良群[18]等以巨大芽孢杆菌CNIB-8508细胞作为生物反应器，利用促进其代谢的蔗糖磷酸化酶进行催化合成α-熊果苷，并考察缓冲溶液 pH 值、缓冲溶液中对苯二酚浓度、对苯二酚与葡萄糖的物质的量比及反应时间等因素对合成α-熊果苷的影响。结果表明， 当CNIB-8508的初始浓度为50 mg/mL，浓度为30 mmol/L 磷酸盐作为缓冲溶液，组织培养液pH 值为6.5时，加入对苯二酚浓度为 5 mmol/L、对苯二酚与葡萄糖物质的量比为 1∶5、温度为30 ℃时反应24 h，该条件下合成α-熊果苷含量达 0.35mg/mL、原料中对苯二酚转化率为74%。用于实验用的酶为蔗糖磷酸化酶的粗酶液，其中的酶浓度较低，其催化合成α-熊果苷的相对有限，致使蔗糖磷酸化酶对苯二酚的选择性较低。2012年，朱松洁[19]等对22 种丝状真菌、酵母菌以及细菌等作为生物反应器培养合成熊果苷的能力进行筛选，对所合成的熊果苷通过高效液相色谱法进行定量确定及比较，结果表明:在所研究的22种菌种中米根霉、白地霉、酵母 910、酵母904以及枯草芽孢杆菌可以将加入的对苯二酚通过催化作用反应合成熊果苷，在上述6者中米根霉的收率最高，浓度达到 441.30 mg/L。同时考察了米根霉作为生物反应器发酵合成熊果苷时的较佳工艺条件，当对苯二酚的初始浓度为 50 mmol/L,麦芽糖作为糖基化的糖基供体，对苯二酚和麦芽糖的物质的量之比为1:3 的条件下，发酵所得熊果苷含量最高。2014年，秦良[20]等以 L-多巴为底物，在酪氨酸酶二酚酶的催化作用下，研究生成的α-熊果苷对二酚酶活性的影响。实验结果表明: α-熊果苷对酪氨酸酶的二酚酶催化反应产生激活效应，反应过程没有迟滞时间; 在一定范围内，随着催化反应系统中 α-熊果苷浓度的增大，而最大反应速度逐渐增大。

2 α-熊果苷的稳定性研究现状

关于熊果苷的稳定性研究主要集中于对β-熊果苷的研究，对α-熊果苷的稳定性及安全性研究较少，因此本文主要从对α-熊果苷稳定性的研究入手。α-熊果苷，是一种含氢醌基团的葡萄糖苷类化合物，因为其具有较好的活肤、除皱、美白、祛斑功效，多作为美白添加剂加入到化妆品中。如今随着α-熊果苷越来越广泛的应用到化妆品中，其安全性的研究逐渐被国内外学者所重视。α-熊果苷为在一定条件下糖基化的氢醌类物质，分子中结构中的葡萄糖分子与氢醌之间形成易断裂的类糖苷键，类糖苷键断裂后，熊果苷可分解产生氢醌类物质。而氢醌，属于酚类化合物，具有毒性，误服微量会使人出现头痛头晕耳鸣面色苍白等症状，接触皮肤则会造成对皮肤细胞的毒害作用。

根据《化妆品卫生规范》中规定，仅允许其使用于染发和人造指甲产品中，在化妆品及护肤品中属于限用物质。氢醌是用于合成熊果苷的起始原料，此外，熊果苷在皮肤细胞中存在的酶作用下分解后，产生微量的氢醌，在使用一段时间后可能会产生病理作用，在作为化妆品添加剂的之前，必须对所合成的熊果苷中氢醌含量进行检测，并对其安全性风险作出必要的评估分析，以保证产品在正常的、合理的条件下使用。因此， α-熊果苷稳定性及安全性的研究对其在化妆品中的配伍性及安全性评价具有一定的指导意义。一般要化妆品达到较好美白疗效，其中熊果苷用量以3%为宜，低于此数值时，熊果苷抑制皮肤中酪氨酸酶催化活性作用不明显，而用量大于3%，则会引起对苯二酚对皮肤损伤的后果，并且前文中所提到的对苯二酚是合成熊果苷的初始原料，在反应结束后难免有残留的未反应的对苯二酚存在。比较熊果苷、维生素C、维生素C衍生物、氢醌、曲酸等 5 种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性进行研究得出结论，其中，熊果苷最为安全有效。对于熊果苷的两种差向异构体，即α和β型，其美白效果和安全性有所差异，据报道，α-熊果苷对黑色素的抑制效果比 β-熊果苷要强约10倍，同时强于目前已知的其他化妆品中添加的美白活性成分[21]。β-熊果苷对培养细胞的细胞膜造成损伤，因此 β-熊果苷的用量与其安全性具有密切的联系。目前当β-熊果苷在化妆品中作为添加剂并且用量约为3% ，小于此剂量时抑制皮肤中酪氨酸酶的催化活性作用较弱，对皮肤增白作用不明显，大于此含量时才能明显对酪氨酸酶活性产生抑制作用，同时对机体细胞产生细胞毒性。相比较而言α-熊果苷在较高浓度下对细胞的生长也不产生影响，因此，美白的有效性和安全性均比β-熊果苷高。2014年，秦良等[22]通过高效液相色谱法检测 α-熊果苷溶液中是否有对苯二酚产生，用来分析基础环境因素对α-熊果苷稳定性的影响，同时对比α-熊果苷和β-熊果苷在不同基础环境条件下的稳定性差异。结果表明，在温度达到100 ℃后，α-熊果苷含量仍保持稳定; 在 pH = 1 及pH=13 时，α-熊果苷化学性质不稳定，而在偏中性条件下，α-熊果苷较稳定; 光照和紫外线照射都会对α-熊果苷稳定性产生影响。由两种熊果苷稳定性对比得知，两者在相同 pH 和光照影响下，稳定性检测结果相同; 而在温度的影响下，β-熊果苷溶液在达到60 ℃后表现出不稳定性。因此，就二者而言，在稳定性方面α-熊果苷就远远优于β-熊果苷。房军等研究了在化妆品使用过程中，β-熊果苷可能转化为氢醌的条件，以及促进转化的因素。结果表明在酸性条件下β-熊果苷于室温静置72 h并未分解为氢醌。而当酸性环境和人工汗液存在的条件下，β-葡萄糖苷酶对β-熊果苷的水解起到了催化作用，并且人工汗液促进作用更强。因此，化妆品在可预见的正常使用情况下，其中含有的β-熊果苷可水解为氢醌被人体吸收，即使β-熊果苷本身应用于化妆品中是安全的，但考虑到其可能在使用过程中转变为氢醌，在安全性方面就远远不及α-熊果苷[23]。

3 展望

植物提取α-熊果苷的实验步骤繁琐、所需时间较长，不利于工业化大规模的进行α-熊果苷的生产。近几年，随着生物合成方式的兴起，以一种低成本、无污染、时间短的方法生物合成α-熊果苷成为了可能。鉴于α-熊果苷优良的美白性能，目前被广泛应用于祛斑药物和化妆品美白护肤领域，研究表明在安全性及稳定性方面，α-熊果苷明显优于β-熊果苷，能够作为更可靠的添加剂加入到各种美白亮肤化妆品中。因此，国内外学者指出，熊果苷市场将作为21世纪国际美白护肤品的市场的主导，同时，应进一步开展熊果苷应用于祛斑药物和化妆品的安全性研究，特别是α-熊果苷安全性研究。

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Research Progress of Alpha Arbutin

Sun Lei，Yao Deli，Yao Dekun，Wu Hailong

(1.Daxing’anLing Lingonberry Boreal Biotech Co., Ltd.,Daxing’anling, Heilongjiang 165012；2. Heilongjiang Biological Engineering and Technology Center For Boreal Forest and Plant，Daxing’ anling，Heilingjiang 165012)

Abstract:The research progress and the development situation of α-arbutin was studied. The research content including mechanism of action of α-arbutin， cosmetics and arbutin in prescription compatibility of other active substances， α-arbutin derivatives and their sources and synthesis methods. Skin whitening effect and industrialized production of α-arbutin. Finally,α-arbutin as currently good whitening agent，efficient,safe,has a broad market prospect.

Key words:α-arbutin;Synthesis;Security

收稿日期：2016-01-18

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划农业领域研究项目(2011BAD08B0303)

*通讯作者：姚德坤，E-mail: ydk2266@163.com。

中图分类号:R285

文献标识码:A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.03.038