异氟烷麻醉后老年大鼠学习/记忆功能改变与脑海马CA1区谷氨酸水平及受体变化的关系

曲向东　徐诚实　曲智俊　周海滨　张丽娜

(北京积水潭医院麻醉科，北京　100035)



异氟烷麻醉后老年大鼠学习/记忆功能改变与脑海马CA1区谷氨酸水平及受体变化的关系

曲向东徐诚实曲智俊周海滨张丽娜1

(北京积水潭医院麻醉科，北京100035)

目的探讨异氟烷麻醉后老年大鼠学习/记忆功能障碍模型中海马CA1区谷氨酸浓度的动态变化对术后认知功能障碍(POCD)的影响机制。方法将111只老年大鼠(≥18月龄)随机分为微透析组(n=38)和Western印迹组(n=73)。将两组大鼠都进一步分为对照组(n=6、10，不接受迷宫训练，吸入空气但不接受异氟烷麻醉)，空气吸入组(n=7、15，接受迷宫训练，吸入空气但不接受麻醉)以及异氟烷麻醉组(n=25、48，接受迷宫训练和异氟烷麻醉)。应用Morris水迷宫测试接受异氟烷麻醉的大鼠麻醉前后的迷宫成绩，并以此为依据将异氟烷麻醉组大鼠进一步分为认知功能明显受损亚组(MIS)和认知功能无明显受损亚组(NMIS)。应用大鼠脑微透析系统收集不同时间点微透析组大鼠脑海马CA1区的脑脊液。脑脊液中的谷氨酸浓度应用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，而兴奋性谷氨酸受体转运体(EAAT)1、EAAT2、N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)1、NMDAR2A/B、α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(AMPAR)以及tau蛋白表达水平的变化通过Western印迹测定。结果接受异氟烷麻醉的大鼠学习/记忆功能明显受损的发生率为12.0%。异氟烷麻醉组大鼠麻醉过程中的谷氨酸浓度均明显低于对照组和空气吸入组(P=0.015和0.011)。麻醉后24 h时，MIS亚组谷氨酸水平明显高于对照组和NMIS亚组(P=0.029，P<0.01)。麻醉后首次水迷宫训练时，MIS组谷氨酸浓度明显高于NMIS组(P=0.032)。麻醉48 h以后各个时间点，MIS亚组谷氨酸水平均明显高于其余三组。Western印迹组认知功能明显受损的大鼠EAAT1的表达明显高于其余3个亚组(P=0.026,0.02，0.032)，而该组各亚组GLT-1、NMDAR1、NMDAR2A/B、AMPAR以及tau蛋白的表达水平均无明显差异。结论异氟烷麻醉学习/记忆功能障碍大鼠模型中海马CA1区谷氨酸水平呈持久性升高，可能与麻醉药引发的学习/记忆功能障碍的病理生理过程有关。而这可能进一步引起EAAT1的表达增加，但EAAT2、NMDAR1、NMDAR2A/B 、AMPAR和tau蛋白等无明显变化。

谷氨酸；异氟烷；学习/记忆功能受损；Morris水迷宫；谷氨酸转运体；谷氨酸受体

作为脑内最丰富且最重要的兴奋性神经递质，是否在术后认知功能障碍(POCD)发病过程中也伴有谷氨酸浓度水平的变化及其变化趋势至今仍不清楚。本实验通过观察异氟烷麻醉和水迷宫训练后老年大鼠脑海马CA1区谷氨酸浓度的动态变化，探讨异氟烷引发的认知功能受损与谷氨酸浓度以及谷氨酸受体之间的关系。

1　材料和方法

1.1材料与分组将111只老年大鼠(≥18月龄)随机分为微透析组(n=38)和Western印迹组(n=73)。将两组大鼠都进一步分为对照组(n=6、10，不接受迷宫训练，吸入空气但不接受异氟烷麻醉)，空气吸入组(n=7、15，接受迷宫训练，吸入空气但不接受麻醉)以及异氟烷麻醉组(n=25、48，接受迷宫训练和异氟烷麻醉)。应用Morris水迷宫测试接受异氟烷麻醉的大鼠麻醉前后的迷宫成绩，并以此为依据将异氟烷麻醉组大鼠进一步分为认知功能明显受损亚组(MIS)和认知功能无明显受损亚组(NMIS)。应用大鼠脑微透析系统收集不同时间点微透析组大鼠脑海马CA1区的脑脊液。脑脊液中的谷氨酸浓度应用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，而兴奋性谷氨酸受体转运体(EAAT)1、EAAT2、N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)1、NMDAR2A/B、α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(AMPAR)以及tau蛋白表达水平的变化通过Western印迹测定。详见本文的前期研究〔1〕。

1.2Western印迹蛋白测定将海马组织称重后置入乙二胺四乙酸(EDFA)缓冲液中研磨均匀。4℃下将混合液12 000 r/min离心10 min后，分离上清液并应用Bradford比色法测定其蛋白浓度。将内含50 μg总蛋白的上清液加入10%聚丙烯酰胺凝胶加样孔中进行电泳，后将凝胶上的蛋白在适当电流下转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。应用溶解于Tris盐酸缓冲液(TBST)的5%脱脂奶粉封闭后，PVDF膜进行一抗孵育，各抗体浓度为：β-actin，1∶4 000,sc-1616-R,Santa Cruz Biotechnology；兴奋性谷氨酸受体转运体(GLAST)，1∶2 500,ab416,Abcam,Cambridge,MA,USA；GLT-1，1∶2 000,ab41621,Abcam,Cambridge,MA,USA；N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR1)，1∶1 000,AB9864,Millipore；NMDAR2A/B，1∶500,AB1548,Millipore；α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(AMPAR)，1∶2 500,Ab1504,Millipore；T-Tau(1∶1 000,sc-32274,Santa Cruz Biotechnology。然后将PVDF膜放入4℃冰箱过夜。将膜用TBST进行洗脱并用经过辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠二抗在室温下孵育1 h。应用增强化学发光法(ECL)试剂盒(Santa Cruz)对蛋白进行免疫荧光检测并在暗室中进行曝光。应用Image-Pro Plus 6.0软件对曝光过的胶片进行扫描分析，并用β-actin对待测指标条带的表达水平进行标准化处理。

1.3统计学方法应用SPSS11.5软件进行方差分析、双变量相关分析。

2　结　果

2.1水迷宫成绩测试结果

2.1.1麻醉前行为学测试结果麻醉前各个时间点各亚组之间ELP均无统计学差异。麻醉后行为学测试成绩：NMIS亚组与空气吸入组在各个时间点上ELP均无统计学差异，而MIS亚组在各个时间点上ELP与空气吸入组和NMIS亚组相比差异显著(P<0.05)。见图1。

图1　Western印迹组麻醉前后行为学测试成绩

2.1.2行为学测试记忆能力麻醉前和麻醉后在定位航行实验测试完毕2 d后进行空间探索实验以测试大鼠对平台空间位置的记忆能力。将大鼠放入撤区平台的水池中90 s观察在此期间内大鼠穿越目标区域的次数。微透析组和Western印迹组各组麻醉前结果无统计学差异。麻醉后微透析组MIS亚组在目标区域内的时间明显低于空气吸入组和NMIS亚组(P=0.013，0.017)，而NMIS亚组与空气吸入组之间无明显统计学差异(图2)。Western印迹组MIS亚组麻醉后在目标区域内的时间明显低于空气吸入组和NMIS亚组(P=0.012，0.034)，而NMIS亚组与空气吸入组之间无明显统计学差异。然而，微透析组和Western印迹组认知功能无明显损害的大鼠在目标区域内的时间与空气吸入组均无明显统计学差异。微透析组：麻醉前接受行为学测试的大鼠在目标区域滞留时间无明显差异，而麻醉后MIS亚组在目标区域滞留时间明显低于空气吸入组和NMIS亚组(P<0.05)。Western印迹组：麻醉前接受行为学测试的大鼠在目标区域滞留时间无明显差异，而麻醉后MIS亚组在目标区域滞留时间明显低于空气吸入组和NMIS亚组(P<0.05)。微透析组和Western印迹组接受行为学测试的大鼠麻醉前后游泳速度均无明显统计学差异(图3)。

图2　麻醉前后微透析组和Western印迹组大鼠定位航行试验在目标区域的时间

图3　微透析组和Western印迹组麻醉前后行为学测试每天平均游泳速度

2.2谷氨酸相关蛋白的表达(Western印迹组)MIS亚组EAAT1的表达水平明显高于对照组、空气吸入组和NMIS亚组(P值分别为0.026,0.020和0.032)，而其余三亚组之间相比较则无明显统计学差异。EAAT2,AMPAR,NMDAR1、NMDAR2A/B和tau蛋白的表达水平各亚组之间无明显统计学差异。见图4。MIS亚组EAAT1表达水平明显高于对照组、空气吸入组和NMIS亚组(P=0.026，0.02，0.032)。而其他指标各组之间均无明显统计学差异。见图4，图5。

1～6：GLAST、GLT-1、AMPAR、NMDAR1、NMDAR2A/B、tau图4　Western印迹组谷氨酸相关蛋白表达

1～4：对照组、空气吸入组、NMIS组及MIS组图5　EAAT1,EAAT2,AMPAR,NMDAR1和NMDAR2A/B相对表达水平及Western印迹条带

3　讨　论

该研究有两项主要发现：(1)异氟烷引起的老年大鼠认知功能受损伴有脑海马CA1区谷氨酸浓度的持续性升高〔3〕；(2)异氟烷诱发的老年大鼠认知功能受损模型中脑海马GLAST表达增加，而谷氨酸运转蛋白(GLT-1)、 NMDAR1,NMDAR2A/B和AMPAR等谷氨酸相关蛋白的表达无明显变化。由于POCD的患者的临床表现与早期阿尔茨海默病(AD)类似，而且POCD可能进一步发展为AD，因此有人认为POCD是AD的一种前期病变，且POCD与AD的病理机制类似〔2〕。谷氨酸被视为哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性经递质〔3〕。正常情况下谷氨酸在长时程增强(LTP)有重要作用，而LTP被认为是学习和记忆过程的基础，大脑海马LTP是记忆形成和巩固过程中神经元活动的客观指标〔4〕。然而，谷氨酸是一把双刃剑，在特定情况下可以从一种正常的神经递质转变为一种神经毒性物质〔5〕。与以上研究不同的是，对大鼠认知功能障碍模型进行了连续微透析，发现在异氟烷引发的认知功能受损中谷氨酸浓度持续明显升高，该趋势从麻醉后24 h开始升高至麻醉后84 h达到高峰，随之谷氨酸浓度开始下降但仍处于高于其他两组的水平并一直持续到实验结束。更为重要的是，麻醉后谷氨酸浓度升高与异氟烷麻醉后大鼠的迷宫成绩之间有明显相关。也就是说，谷氨酸浓度越高，学习记忆能力越差〔1〕。正如Lipton SA等的观点，谷氨酸的兴奋性毒性作用是以持续的、轻度的、慢性的、紧张性的方式而非位相性的方式起作用的〔6〕。正因为神经元受损，因此细胞内的谷氨酸外流至细胞外间隙进而引发脑脊液中谷氨酸浓度升高。而此持续缓慢的谷氨酸浓度轻度升高可能是异氟烷引发的认知功能受损的早期表现。虽然GLAST和GLT-1的表达增加与许多神经疾病有关，包括AD或AD样病变，但是这些研究成果之间仍然存在争议。最近研究发现，有报道称皮层下白质EAAT1和EAAT2在缺血初始阶段表达水平升高而在随后的再灌注阶段表达水平明显降低〔7〕。研究发现在AD早期阶段EAAT1和EAAT2的表达水平也有明显升高〔8〕。本实验中发现GLAST的表达水平明显升高，而GLT-1的表达水平则无明显变化。由于两种兴奋性氨基酸转运体的分布情况不同，GLAST在海马组织中也有中等程度的分布。本文认为引起海马组织中GLAST表达升高的原因主要有两个：①GLAST较GLT-1对于谷氨酸更加敏感，因此，GLAST对于高谷氨酸浓度的反应要早于GLT-1；②GLT-1在脑组织内含量极为丰富，其含量约占脑细胞膜蛋白含量的1%。因此，虽然在本试验中也发现GLT-1的表达水平升高，但是由于其基数大，因此其表达水平的变化没有GLAST明显。虽然GLAST的表达升高令人费解，但是其可能表明这是神经系统对高谷氨酸浓度的一种保护性反应机制，以减轻兴奋毒性效应对于神经系统的损伤。海马GLAST的表达对于海马谷氨酸稳态的维持至关重要。反义敲除GLAST会引起海马中谷氨酸浓度的异常升高，而且GLAST还可以提高脑组织对谷氨酸兴奋毒性的抵抗能力〔9〕。因此，考虑到微透析实验中谷氨酸浓度的持续性升高，将GLAST的表达升高归因于海马组织中的高谷氨酸浓度。本文也认为，在异氟烷引发的认知功能障碍中GLAST表达水平的升高是谷氨酸能系统的早期变化。

1徐诚实，曲向东，吴安石，等.异氟烷麻醉后老年大鼠学习/记忆功能改变与脑海马CA1区谷氨酸水平变化的关系〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(19):5417-21.

2Ritchie K,Carriere I,Ritchie CW,etal.Designing prevention programmes to reduce incidence of dementia:prospective cohort study of modifiable risk factors〔J〕.BMJ,2010；341(9739):c3885.

3Xie Z,Culley DJ,Dong Y,etal.The common inhalation anesthetic isoflurane induces caspase activation and increases amyloid beta protein level in vivo〔J〕.Ann Neurol,2008;64(6):618-27.

4Planel E,Richter KE,Nolan CE,etal.Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia〔J〕.J Neurosci,2007;27(12):3090-7.

5Sattler R,Tymianski M.Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death〔J〕.Mol Neurobiol,2001;24(1-3):107-29.

6Lipton SA,Rosenberg PA.Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders〔J〕.N Engl J Med,1994;330(9):613-22.

7Xue B,Chen EC,He N,etal.Integrated regulation of AMPA glutamate receptor phosphorylation in the striatum by dopamine and acetylcholine〔J〕.Neuropharmacology,2016;3908(16):3014.

8Litim N,Morissette M,Di Paolo T.Metabotropic glutamate receptors as therapeutic targets in Parkinson's disease:an update from the last 5 years of research〔J〕.Neuropharmacology,2016;3908(16):3010.

9Seo S,Liu P,Leitch B.Spatial learning-induced accumulation of agmatine and glutamate at hippocampal CA1 synaptic terminals〔J〕.Neuroscience,2011;192:28-36.

〔2015-12-09修回〕

(编辑袁左鸣)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.015

张丽娜(1977-)，女，副主任医师，主要从事麻醉与脑保护研究。

曲向东(1976-)，男，主治医师，主要从事麻醉与脑保护研究。

R614.2

A

1005-9202(2016)14-3384-04；

1青岛市市立医院麻醉科