PI3K在2型糖尿病模型大鼠骨质疏松中的作用及LY294002的干预效果

郭玉卿　王丽娜　刘　璠　杨爱格　董闪闪　康　岩　张趁茹　周慧敏

(河北医科大学第一医院内分泌科，河北　石家庄　050030)



PI3K在2型糖尿病模型大鼠骨质疏松中的作用及LY294002的干预效果

郭玉卿王丽娜刘璠杨爱格董闪闪康岩张趁茹周慧敏

(河北医科大学第一医院内分泌科，河北石家庄050030)

目的探讨PI3K在2型糖尿病(T2DM)骨质疏松(OP)中的作用及LY294002的干预效果。方法选择75只清洁级近交雌性Wistar 大鼠，随机分为假手术组(NS组)，T2DM OP模型组(M组)和LY294002干预组(IN组)。M组和IN组大鼠均采用高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备T2DM大鼠模型，两组大鼠均采用手术摘除卵巢的方式制作OP大鼠模型。IN组在模型制作成功后注射溶解于二甲基亚砜(DMSO)的LYP294002。采用SABC免疫组化法检测PI3K、AKT-1、AKT-2在骨骼肌中的表达情况。结果M组大鼠PI3K表达水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组显著低于NS组(P<0.05)，M组显著高于IN组(P<0.05)；M组大鼠AKT-1表达水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组显著低于NS组(P<0.05)，M组显著高于IN组(P<0.05)；M组大鼠AKT-2表达水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组显著低于NS组和M组(P<0.05)。结论PI3K/AKT信号通路在T2DM大鼠OP大骨骼肌的活性降低，LY294002会进一步降低T2DM大鼠OP大骨骼肌PI3K/AKT信号通路的活性。

2型糖尿病；骨质疏松；PI3K；LY294002

研究表明糖尿病和骨质疏松直接存在一定的相关性〔1〕，2型糖尿病(T2DM)由于体内胰岛素水平不同，对骨量的影响尚不明确。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路是重要的胰岛素信号通路之一，是胰岛素发挥生物学效应的重要传导通路，在骨骼肌、肝脏以及脂肪细胞均有分布〔2〕。也有研究认为PI3K、AKT是骨代谢的主要调节因子，能够促进成骨细胞前体向成熟成骨细胞分化，促进骨形成。但关于PI3K在T2DM OP形成过程中的作用尚不明确。此外，LY294002为一种能够阻断细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂，能够抑制PI3K/AKT信号途径的传导〔3〕。本研究旨在探讨PI3K在T2DM OP中的作用及LY294002的干预作用。

1　材料与方法

1.1药品与试剂PI3K兔抗鼠多克隆抗体INS、AKT-1兔抗鼠多克隆抗体、AKT-2兔抗鼠多克隆抗体一抗，武汉博士德生物技术有限公司；S-P检验试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，北京中山金桥生物技术有限公司；苏木素、分化液、反蓝液、中性树胶、磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸缓冲液、多聚赖氨酸防脱玻片，河北博海生物工程开发有限公司；LY294002〔易莱生物科技(中国)有限公司〕，链脲佐菌素(STZ，上海前尘生物科技有限公司)。

1.2动物模型制备选择75只清洁级近交雌性Wistar 大鼠，体重180～200 g，鼠龄2.5～3个月。适应性饲养1 w后，随机分为假手术组(NS组)，T2DM OP模型组(M组)和LY294002干预组(IN组)。M组和IN组大鼠均采用高脂饲料喂养联合小剂量STZ腹腔注射制备T2DM大鼠模型，T2DM模型制作成功后，两组大鼠均采用手术摘除卵巢的方式制作OP大鼠模型。IN组在模型制作成功后注射溶解于二甲基亚砜(DMSO)的LYP294002。

1.3标本制备三组大鼠分组造模成功后第4、8、12周随机选取5只处死，取右侧股四头肌，切成约5 mm×5 mm×5 mm，之后经多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后用于苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化监测。

1.4骨骼肌免疫组化检测采用SABC免疫组化法检测PI3K、AKT-1、AKT-2在骨骼肌中的表达情况：(1)切片，将蜡块标本放入2℃～8℃冰箱中静置1 h，取出3 μm厚度的连续切片，粘贴到黏合剂多聚赖氨酸处理过的载玻片上，并将切片置于60℃恒温烤箱中放置3 h备用。(2)脱蜡，切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，每步20 min。(3)脱苯，切片在梯度酒精中脱苯，酒精梯度设置为100%，100%，95%，90%，80%和70%共6步，每步3 min，脱苯完成后将切片取出，用PBS清洗2次，每次3 min。(4)3%过氧化氢灭活，用蒸馏水配置3%过氧化氢，室温30 min灭活内源性酶，PBS清洗2次，每次3 min。(5)封闭，切片在湿盒中，滴加正常山羊血清在室温下封闭20 min。(6)一抗工作液配置，使用蒸馏水配置一抗工作液，浓度分别为PI3K 1∶150；AKT-1 1∶100；AKT-2 1∶100。(7)滴加一抗，滤纸吸干切片上正常的山羊血清后滴加配置好的一抗工作液，将湿盒放入4℃冰箱内孵育过夜；1 d后拿出湿盒，室温放置恢复室温，用PBS清洗除去一抗。(8)滴加二抗，从PBS中取出切片，擦干组织周围的液体，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG(二抗)，37℃恒温水浴箱内孵育30 min，PBS清洗。(9)滴加辣根霉标记卵白素工作液。(10)DAB显色，复染和脱水。(11)透明化处理和封片后置于显微镜下观察。

1.5免疫组化结果判断PI3K、AKT-1、AKT-2均以在骨骼肌细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片均在显微镜下选择5个高倍视野(×400)，应用IPP多功能真彩色细胞图像分析管理系统从阳性细胞百分比及染色强弱进行评价。a为阳性细胞百分比，无阳性细胞为0，阳性细胞1%～10%为1，11%～50%为2，51%～80%为3，81%～100%为4；b为阳性细胞染色强弱，阴性为0，弱阳性为1，中度阳性为2，强阳性为3。a、b两项的乘积为该标本的免疫组化评分。

1.6统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1三组大鼠PI3K表达水平比较在卵巢去除后第4周时，M组大鼠PI3K表达水平(4.6±0.8)显著低于NS组(8.1±0.4)(t=19.566，P<0.05)，IN组(3.4±1.1)显著低于NS组(t=6.617，P<0.05)，M组显著高于IN组(t=7.262，P<0.05)；去卵巢后第8周时，M组大鼠PI3K表达水平(3.5±0.5)显著低于NS组(6.5±0.7，P<0.05)，IN组(2.7±0.9)显著低于NS组和M组(t=6.139，7.770；P<0.05)；去卵巢后第12周时，M组大鼠PI3K表达水平(3.4±0.6)显著低于NS组(6.4±0.8，t=15.000，P<0.05)，IN组(2.3±0.6)显著低于NS组和M组(t=5.501,11.196；P<0.05)。

2.2三组大鼠AKT-1、AKT-2表达水平比较在卵巢去除后第4周时，M组大鼠AKT-1、AKT-2表达水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组均显著低于NS组(P<0.05)，M组大鼠AKT-1水平显著高于IN组(P<0.05)，而AKT-2水平比较无显著差异(P>0.05)；去卵巢后第8周时，M组大鼠AKT-1、AKT-2表达水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组显著低于NS组和M组(P<0.05)；去卵巢后第12周时，M组大鼠AKT-1、AKT-2水平显著低于NS组(P<0.05)，IN组水平显著低于NS组和M组(P<0.05)。见表1。

表1　三组大鼠AKT-1、AKT-2表达水平比较

与NS组比较：1)P<0.05;与M组比较：2)P<0.05

3　讨　论

糖尿病是由遗传易感因素、免疫功能紊乱、精神因素等多种致病因子共同作用下引起的一种代谢综合征，以胰岛素含量绝对或相对不足为主要特点。目前糖尿病在我国具有较高的发病率，约为9.7%，且这一发病率近年来受多种因素影响呈现不断递增的趋势〔4〕。1型糖尿病由于胰岛素含量的绝对缺失造成骨量降低是确切的，但T2DM与OP的关系尚未得到确定。

本研究之所以选择骨骼肌作为本次组织研究的对象，主要是由于骨骼肌是胰岛素刺激葡萄糖摄取的主要靶组织，同时是胰岛素抵抗发生的主要场所。本研究表明肌肉的运动能够抑制肝糖输出，缓解机体胰岛素抵抗。而且骨骼肌通过收缩产生的肌力以及通过骨应变调节成骨细胞和破骨细胞功能代谢影响了骨细胞的代谢〔5〕。总之，骨骼肌与OP存在密切关系，而同时也是血糖调节发生的主要场所，是细胞增殖、转移、黏附和死亡过程的重要调节者。尽管其是一种重要的胰岛素信号调节通路，但其同时与骨组织形成有着密切关系，如能够促进碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)等成骨分化标志物的表达，促进骨量的增加〔6〕。同时，PI3K/AKT信号通路能够参与调控破骨细胞分化、存活和骨吸收，通过抑制PI3K/AKT信号通路活性能够使破骨细胞吸收能量减弱而增加骨量，缓解OP〔7〕。

本研究结果说明T2DM OP大鼠PI3K/AKT信号通路受到抑制，使机体成骨量减少而发生了OP。从趋势上看M组大鼠在第8周时与第4周相比存在上升或降低不显著的现象，这可能是由于机体自身存在的某种恢复机制，代偿性的有潜在增强PI3K/AKT信号通路活性的作用，但这种作用并不持久。由于PI3K/AKT信号通路的双向调节功能，通过抑制其活性，可降低破骨细胞骨吸收功能活性，对破骨细胞骨吸收功能的抑制也是防治OP的主要药理基础。总之，PI3K/AKT信号通路在T2DM大鼠OP大骨骼肌的活性降低，LY294002会进一步降低T2DM大鼠骨OP大骨骼肌PI3K/AKT信号通路的活性。但关于LY294002对OP症的最终影响结果尚需进一步的研究证实。

1尹嘉晶,彭永德.糖尿病与骨质疏松〔J〕.中华内分泌代谢杂志,2014;30(5):449-52.

2刘中天,尚靖.骨代谢分子信号通路研究进展〔J〕.亚太传统医药,2012;8(6):222-4.

3Chun GX,Zhu BS,Fan XQ,etal.Effects of LY294002 on the invasiveness of human gastric cancer in vivo in nude mice〔J〕.World J Gastr,2009;15(40):5044-52.

4郝改凤,王团娥.糖尿病发病率相关因素调查分析及护理干预〔J〕.齐鲁护理杂志,2014;21(1):37-8.

5Hoeks J,de Wilde J,Hulshof MF,etal.High fat diet-induced changes in mouse muscle mitochondrial phospholipids do not impair mitochondrial respiration despite insulin resistance〔J〕.PLoS One,2011;6(11):e27274.

6Wu CM,Chen PC,Li TM,etal.Si-Wu-tang extract stimulates bone formation through PI3K/AKT/NF-kappaB signaling pathways in osteoblasts〔J〕.BMC Complement Altern Med,2013;13:277.

7Adapala NS,Brebe MF,Tsygankov AY,etal.Loss of Cbl-PI3K interaction enhances osteoclast survival due to p21-Ras medicated PI3K activation independent of Cbl-b〔J〕.J Cell Biochem,2014;115(7):1277-89.

〔2015-12-22修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.012

河北省卫生厅项目(20130264)

周慧敏(1966-)，女，博士，主任医师，主要从事糖尿病研究。

郭玉卿(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事糖尿病与骨质疏松研究。

R589

A

1005-9202(2016)14-3377-03；