延龄草提取物对异质性及多因性阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆与抗氧化能力的影响

张忠立　左月明

(江西中医药大学药学院，江西　南昌　330004)



延龄草提取物对异质性及多因性阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆与抗氧化能力的影响

张忠立左月明

(江西中医药大学药学院，江西南昌330004)

目的探讨延龄草提取物对异质性及多因性阿尔茨海默病(H/MAD)模型大鼠学习记忆与抗氧化能力的影响。方法先腹腔注射D-半乳糖促衰老，再反复结扎双侧颈总动脉致脑缺血，最后大鼠侧脑室一次性注射Aβ1～40制备H/MAD模型。实验设空白组，H/MAD模型组，盐酸多奈哌齐组，延龄草总提物高、中剂量组，水洗脱物高、中剂量组，30%乙醇洗脱物高、中剂量组，60%乙醇洗脱物高、中剂量组，85%乙醇洗脱物高中剂量组。各给药组于术后3 d开始灌胃给药6 d。采用Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力，并测定大鼠血清中总抗氧化物(T-AOC)、乙酰胆碱酯酶(TChE)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力。结果与模型组比较，给药各组能明显缩短潜伏期、增加过台次数、在第四象限逗留时间延长，并使大鼠血清中T-AOC含量升高、降低TChE活力，提高SOD、GSH-Px的活性，降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)。结论延龄草提取物(尤其是85%乙醇洗脱物中剂量、60%乙醇洗脱物高剂量)对H/MAD模型大鼠学习记忆有明显的改善作用，其机制可能与增强T-AOC活力、降低TChE含量及提高H/MAD大鼠的抗氧化作用相关。

延龄草提取物；异质性及多因性阿尔茨海默病(H/MAD)；学习记忆；抗氧化能力

延龄草是传统的名贵中药，为百合科植物延龄草TrilliumtschonoskiiMaxim.的干燥根及根茎，味甘、性平，有小毒，具有延年益寿的功效〔1，2〕。主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、脑震荡后遗症等疾病，是恩施土家族著名民间药之一〔2〕。现代药理研究表明，其具有抗氧化、抗衰老、降血压、抗炎镇痛、调节免疫等作用〔3～5〕。笔者先期建立了异质性及多因性阿尔茨海默病(H/MAD)模型，本文在此基础上研究延龄草提取物对H/MAD模型大鼠学习记忆和抗氧化能力的影响，初步探讨延龄草抗氧化、防衰老和改善学习记忆的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级健康SD雄性大鼠156只，体重350～400 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证编号为SCXK(湘)2012-0005。

1.2主要药物及试剂延龄草70%乙醇总提取物(1 g相当于生药6.7 g)，经大孔吸附树脂分离的水洗脱物(1 g相当于生药12.2 g)、30%乙醇洗脱物(1 g相当于生药83.3 g)、60%乙醇洗脱物(1 g相当于生药55.6 g)、85%乙醇洗脱物(1 g相当于生药26.7 g)由本实验室自行制备；盐酸多奈哌齐购于卫材药业有限公司；D-半乳糖(Sigma公司)；β淀粉样蛋白(Aβ)1～40(Sigma公司)；总抗氧化物(T-AOC)、乙酰胆碱酯酶(TChE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3主要仪器ZS-B型脑立体定位仪、Morris水迷宫视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)，UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.4动物造模及分组处理156只健康SD雄性大鼠随机分为空白组，H/MAD模型组，盐酸多奈哌齐组，延龄草总提物高、中剂量组，水洗脱物高、中剂量组，30%乙醇洗脱物高、中剂量组，60%乙醇洗脱物高、中剂量组，85%乙醇洗脱物高、中剂量组，每组12只。空白组不予处理。模型组与给药组每天腹腔注射D-半乳糖，4 w后先进行双侧颈总动脉反复结扎间断性阻断血流，造成脑缺血性病灶，术后，取未死亡的状态良好的大鼠再予脑内注射凝聚态Aβ1～40〔6〕。造模术后第3天，模型组开始灌胃2%聚山梨酯水溶液6 d，1次/d；给药组开始连续灌胃给药6 d，1次/d。末次给药后，测定大鼠的学习记忆功能及血清中的各项生化指标。

1.5Morris水迷宫实验预先在水池里注入墨水使水面高出平台1～2 cm，水池分为4个象限。将平台放在第四象限中间，在其他三个象限任选一点面向水池池壁将大鼠放入水中，实验历时5 d，训练4 d，第5天将平台移走，每只大鼠游1 min，记录每只大鼠第一次经过原平台的时间(潜伏期)、每只大鼠在1 min内经过平台的次数，计算每只大鼠在第四象限游泳的时间(t4)占整个游泳时间(t总)的百分比和在第四象限游泳的距离(I4)占整个游泳距离(I总)的百分比〔6〕。

1.6各生化指标测定与方法大鼠水迷宫实验结束后，心脏采血，离心后取血清，按试剂盒说明书测定血清T-AOC、TChE、SOD、MDA、GSH-Px等水平。

1.7统计学方法应用SAS9.3软件行单因素方差分析或最小显著差法检验。

2　结　果

2.1延龄草提取物对Morris水迷宫实验结果的影响与空白组比较，模型组大鼠潜伏期延长、过台次数减少，在第四象限逗留时间和距离短(P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、延龄草提取物各组能缩短潜伏期、增加过台次数，在第四象限逗留时间和距离延长(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脱物中剂量组、60%乙醇洗脱物高剂量组和水洗脱物中剂量组效果更明显。见表1。

表1　延龄草提取物对H/MAD模型大鼠空间探索能力的影响±s，n=10)

与空白组比较：1)P<0.01；与H/MAD模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.2延龄草提取物对H/MAD模型大鼠血清中T-AOC和TChE含量的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中T-AOC含量降低，TChE活力增强(P<0.01)；给药各组能提高T-AOC含量，降低TChE活力，与模型组相比具有显著差异(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脱物中剂量组、60%乙醇洗脱物高剂量组治疗效果更明显。见表2。

2.3延龄草提取物对H/MAD模型大鼠血清中SOD、MDA和GSH-Px含量的影响与空白组比较，模型组大鼠SOD、GSH-Px明显降低(P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组可使MDA水平下降(P<0.05)，提高SOD、GSH-Px的活力(P<0.01)；与模型组比较，延龄草提取物各组能使MDA水平明显下降(P<0.05或P<0.01)，而SOD、GSH-Px明显上升(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脱物中剂量组、60%乙醇洗脱物高剂量组效果更明显。见表2。

表2　延龄草提取物对H/MAD模型大鼠血清中T-AOC和TChE、SOD、MDA、GSH-Px含量的影响

3　讨　论

本实验采用H/MAD药物筛选模型，通过Morris水迷宫实验检测动物行为学改变显示造模成功。AD患者脑组织神经元细胞中存在明显的氧化应激反应。正常情况下，体内存在一套有效的抗氧化防御系统，能及时清除过量的自由基，从而保护细胞膜结构和功能的完整。病理情况下，机体产生的自由基超过机体的清除能力，促使疾病进一步发展。T-AOC是机体抗氧化能力的总体评价指标，其水平可反映机体抗氧化系统对外来刺激的代偿能力及机体自由基代谢的状态〔7〕。TChE是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶，直接参与自主神经功能调节、大脑思维、记忆等功能〔8〕。SOD能特异性结合体内超氧阴离子，可直接捕捉和清除超氧阴离子等自由基，催化超氧阴离子生成过氧化氢和氧分子，阻断或终止自由基连锁反应链〔7〕。GSH-Px是重要的过氧化物分解酶，与SOD协同作用清除机体过多的自由基和过氧化物〔9〕。而MDA含量的变化可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度〔10〕。本实验结果显示，H/MAD模型组大鼠脑组织内自由基产生增加，发生了明显的脂质过氧化反应。延龄草提取物能使模型大鼠血清中T-AOC的活力恢复，明显提高SOD、GSH-Px的活力，增强机体清除自由基的能力；降低TChE、MDA的含量，以减少机体受自由基损伤的程度，表现出良好的抗氧化损伤作用。由此可知，延龄草提取物(尤其是85%乙醇洗脱物中剂量、60%乙醇洗脱物高剂量)可通过有效清除氧自由基、提高机体的抗氧化能力提高模型动物的学习记忆能力，对AD的发生发展起到一定的防治作用。

1中国科学院武汉植物所.湖北植物志〔M〕.第4册.武汉：湖北科技出版社，2003：453.

2方志先，朱诗立.恩施州民族医药研究丛书·恩施本草精选〔M〕.北京：国际文化出版公司，2002：302.

3肖本见，陈国栋，谭志鑫，等.头顶一棵珠抗炎和免疫作用的实验研究〔J〕.安徽医药，2005；9(4)：246-8.

4黄丽亚，叶嗣颖.延龄草续断上调抗氧化酶表达作用的比较研究〔J〕.辽宁中医杂志，2006；33(8)：1012-3.

5喻玲玲，邹坤，汪鋆植，等.延龄草提取物抗炎、镇痛和凝血作用的研究〔J〕.时珍国医国药，2008；19(5)：1178-80.

6左月明，张忠立，杨炳友，等.黑水缬草抗老年痴呆活性部位的研究〔J〕.中药新药与临床药理，2010；21(1)：15-8.

7马宝慧，高永胜，潘桂兰，等.木樨草素对高脂血症模型大鼠血浆一氧化氮水平与抗氧化能力的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(8)：2176-8.

8尤力都孜·买买提，热比姑丽·伊斯拉木，艾西木江·热甫卡提闫明，等.新疆曼陀罗子对大鼠组织匀浆单胺氧化酶及乙酰胆碱酯酶的影响〔J〕.中国药业，2012；21(23)：4-5.

9刘玲飞，陈文材，刘佳微，等.芹菜素处理雄性大鼠肝、脑、睾丸、肾和血清某些生化指标的变化〔J〕.毒理学杂志，2014；28(3)：227-30.

10王传鹏，杨超，赵骏，等.芹菜素对雄性小鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力影响〔J〕.中国实用医药，2013；8(6)：21-2.

〔2015-12-19修回〕

(编辑袁左鸣)

Effect of extracts from Trillium tschonoskii on spatial learning memory and antioxidant capacity in rat model of heterogeneity/multi-factors′ Alzheimer′s disease

ZHANG Zhong-Li，ZUO Yue-Ming.

College of Pharmacy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,Jiangxi,China

ObjectiveTo screen effect of extracts from Trillium tschonoskii on spatial learning memory and antioxidant capacity in rat model of heterogeneity/multi-factors′ Alzheimer′s disease(H/MAD).MethodsThe experiment was set normal control,H/MAD model,Aricept groups,high and middle dose groups of total extract of Trillium tschonoskii,water elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,30% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,60% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,85% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii.Morris water maze was applied to test the spatial learning memory ability.Meanwhile,plasma contents of T-AOC,TChE,SOD,MDA and GSH-Px were detected.ResultsCompared with that of model group,the incubating period of drug delivery groups were reduced，through the platform times were increased，stay time in the fourth quadrant were extended，and the content of T-AOC were increased，TChE in serum vitality were reduced,SOD and GSH-Px in serum activity were increased,the level of MDA in serum content were decreased(P<0.05,P<0.01).ConclusionsThe extract of Trillium tschonoskii(especially 85% ethanol elution middle dose and 60% ethanol elution high dose)has obviously improvement effect on spatial learning memory in H/MAD model rats,its mechanism might be associated with the enhance of T-AOC activity and lower TChE content,effectively inhibit the lipid peroxide and remove excess free radicals in the body,significantly improve the antioxidant capacity of H/MAD rats.

Trillium tschonoskii extract;Heterogeneitys/Multi-factors'Alzheimer's disease;Learning memory;Antioxidant capacity

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.006

国家自然科学基金项目(81260631)

左月明(1978-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事天然药物资源的药效物质基础与分子机制研究。

张忠立(1979-)，男，副教授，硕士，主要从事天然药物的药效物质基础研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)14-3362-03；