车前草总黄酮对大鼠前列腺增生的治疗作用及机制

王琳琳　白　莉

(河南中医学院药学院，河南　郑州　450046)



车前草总黄酮对大鼠前列腺增生的治疗作用及机制

王琳琳白莉

(河南中医学院药学院，河南郑州450046)

目的探讨车前草总黄酮对大鼠前列腺增生(BPH)的治疗作用及机制。方法清洁级雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、法舒地尔组、车前草总黄酮低、中、高剂量组(n=8)。除对照组外，其余各组大鼠皮下注射丙酸睾酮(7.5 mg/kg，1次/d，连续10 d)复制BPH模型，车前草总黄酮组分别给予车前草总黄酮灌胃治疗(分别给予1 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg灌胃，1次/d，持续60 d)，法舒地尔组给予法舒地尔(5 mg/kg，1次/d，持续60 d)灌胃治疗。分析各组大鼠前列腺湿重、前列腺指数、RhoA/ROCK通路蛋白及细胞凋亡蛋白的表达。结果研究发现前列腺增生大鼠前列腺湿重及前列腺指数水平明显升高，促进凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明显升高而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，RhoA-ROCK1/2和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达明显升高而转化生长因子(TGF)-β表达明显降低(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述指标的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)。结论车前草总黄酮能够通过抑制RhoA/ROCK通路蛋白和细胞凋亡过程发挥改善丙酸睾酮引起的大鼠BPH病理过程。

前列腺增生；车前草总黄酮；法舒地尔；RhoA/ROCK信号通路；细胞凋亡

前列腺增生(BPH)主要表现为尿频、尿急、尿失禁和夜尿增多等，但发病与吸烟、酗酒、年龄增长等相关，但是其确切的发病机制尚不明确〔1〕。RhoA/Rho激酶(ROCK)信号转导通路是细胞内普遍存在的信号转导通路，且与多种生殖系统疾病的发生及发展密切相关〔2〕。本研究旨在分析BPH的发病机制及车前草总黄酮的干预作用。

1　材料与方法

1.1仪器垂直电泳仪购自ABI公司(MINI-PROTEAN TETRA CELL)；半干转膜仪购自北京六一仪器厂(TE70XP)；全波长酶标仪购自赛默飞世尔(Multiskan Spectrum型)；全自动生化分析仪购自罗氏公司(MODULE P800)；组织匀浆仪购自Roche Applied Science(MagNA Lyser)。

1.2药品与试剂丙酸睾酮注射液(1 ml：25 mg)购自科伦药业(国药准字H40123555)；总蛋白提取试剂盒(Lot20141017)及蛋白定量试剂盒(Lot20141124)购自南京建成生物工程研究中心；半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白检测试剂盒购自Omega公司；Caspase-9蛋白检测试剂盒购自R&D公司；Bax和Bcl-2蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白检测试剂盒购自Elab Science公司；RhoA蛋白检测试剂盒购自美国BIOO公司；ROCK1/2蛋白检测试剂盒购自Abcam公司。所有操作过程均按照说明书进行。

1.3动物清洁级雄性SD大鼠48只，购自上海斯莱克实验动物中心，许可证号SCXK(沪)20080033，大鼠体重210～230 g，均在恒温(23℃±2℃)恒湿(55%±5%)条件下适应性饲养7 d，期间自由饮食。

1.4模型复制除对照组外，其余各组大鼠给予一次性皮下注射丙酸睾酮(3 mg·kg-1·d-1)，对照组进行皮下注射等剂量的精制麻油。7 d后车前草总黄酮组和法舒地尔组分别给予车前草总黄酮(低剂量组：1 mg/kg；中剂量组5 mg/kg；高剂量组：10 mg/kg)和法舒地尔(5 mg/kg)灌胃治疗，对照组和模型组给予等剂量的溶剂(CMC-Na)灌胃。连续灌胃30 d后颈动脉放血处死动物。

1.5观察指标本研究分析BPH大鼠前列腺指数变化，前列腺组织中细胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspse-9及Bax/Bcl-2表达；检测RhoA/ROCK通路蛋白RhoA及ROCK1和ROCK2蛋白表达；分析组织中TNF-α及转化生长因子(TGF)-β蛋白变化。

1.6免疫印迹法组织于冰水浴中匀浆后进行蛋白定量。以等量总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳，待溴酚蓝移至凝胶下端后停止电泳。半干法转膜2 h，然后将纤维素膜用5.0%脱脂牛奶封闭1 h。无菌磷酸缓冲液冲洗3次(10 min/次)后与一抗4℃条件下杂交孵育4 h；无菌磷酸缓冲液冲洗3次(10 min/次)，然后与二抗杂交孵育4 h，无菌磷酸缓冲液冲洗3次(10 min/次)。然后进行显色、定影，并计算光密度。以β-actin作为内参进行蛋白分子的相对表达计算。

1.7前列腺湿重及指数分析大鼠灌胃治疗24 h后称取大鼠体重，颈动脉放血处死后分离大鼠前列腺，并沉重，计算前列腺指数。前列腺指数=前列腺湿重(mg)/大鼠体重(g)。

1.8统计学方法采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2　结　果

2.1前列腺湿重及前列腺指数变化及车前草总黄酮的改善作用BPH大鼠前列腺湿重及前列腺指数水平明显高于对照组(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述指标的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)。见表1。

2.2细胞凋亡蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用BPH大鼠前列腺组织促进凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明显高于对照组而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述指标的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)。见表2。

表1　前列腺湿重及前列腺指数变化及车前草总黄酮的改善作用±s,n=8)

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与车前草总黄酮高剂量组比较：3)P<0.01；下表同

表2　细胞凋亡蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用分析±s,n=8)

2.3RhoA蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用BPH大鼠前列腺组织RhoA蛋白水平明显高于对照组(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述RohA蛋白表达的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)。见图1。

2.4ROCK1、ROCK2蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用BPH大鼠前列腺组织ROCK1和ROCK2蛋白水平明显高于对照组(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述ROCK1及ROCK2蛋白表达的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)，见图2。

2.5TGF-β及TNF-α蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用BPH大鼠前列腺组织TNF-α蛋白水平明显高于对照组而TGF-β蛋白水平明显降低(P<0.01)；而车前草总黄酮能够有效改善上述蛋白表达的异常(P<0.01)，且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著(P<0.01)。见图3。

图1　RhoA蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用

图2　ROCK1、ROCK2蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用

图3　TGF-β及TNF-α蛋白表达变化及车前草总黄酮的改善作用

3　讨　论

BPH已成为影响老年人健康和生活治疗的主要疾病之一，但是其确切的发病机制尚不明确。本研究表明车前草总黄酮能够通过抑制RhoA/ROCK通路蛋白和细胞凋亡过程发挥改善丙酸睾酮引起的大鼠BPH病理过程。

RhoA/ROCK通路异常参与了多种病理过程的发生及发展过程，且可能是药物干预治疗的潜在靶点〔3〕。在研究辛伐他汀通过Rho/Rho激酶信号通路抑制高血压模型大鼠的心血管重构的研究中发现异常的RhoA蛋白信号通路与大鼠心血管重构密切相关，而辛伐他汀能够通过抑制该通路改善高血压大鼠的血管重构过程〔4〕。在研究miR-146a通过抑制ROCK1基因的表达促进去势抵抗性前列腺癌细胞凋亡时发现前列腺癌细胞凋亡过程与ROCK1蛋白的表达变化密切相关，且ROCK2 siRNA能够对自发性高血压大鼠勃起功能产生明显的影响〔5〕。本研究表明ROCK信号通路参与了大鼠前列腺的增生过程，且可以作为药物治疗的靶点。细胞凋亡是由细胞凋亡蛋白参与、维持机体内环境稳定的重要过程。以往的研究证实益肾通胶囊治疗后BPH患者前列腺组织中促凋亡蛋白明显升高而抑凋亡蛋白的表达明显降低，即细胞凋亡过程参与了BPH患者前列腺异常过程〔6〕。以往的研究也发现A1蛋白与前列腺特异性抗原对前列腺癌与BPH临床诊断具有重要的参考价值〔7〕。方志启等〔8〕也发现凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax的表达与BPH的发生、发展及患者预后密切相关。本研究也表明细胞凋亡过程也参与了大鼠BPH过程，且可作为车前草总黄酮的作用靶点。

炎症反应参与了细胞内几乎所有的病理过程，且与前列腺的多种病理过程密切相关。在研究水飞蓟宾磷脂复合物对大鼠自身免疫性前列腺炎炎性细胞因子影响的研究中发现大鼠自身免疫性前列腺炎的发生与机体内炎症反应因子水平异常相关，且药物可通过改善炎症反应发挥治疗作用〔9〕。以往的研究也发现当归贝母苦参煎剂能通过调节TNF-α的异常表达对实验性慢性细菌性前列腺炎发挥治疗作用〔10〕，且白细胞介素(IL)-10和TNF-α在BPH及前列腺癌的临床诊断中具有重要的参考价值〔11〕。王磊等〔12〕也证实合并组织学炎症的BPH组织中IL-6、TNF-α表达存在明显的异常，且可作为临床诊断的重要标志物。本研究表明TNF-α、TGF-β也与大鼠BPH过程密切相关。因此，车前草总黄酮能够通过抑制RhoA/ROCK通路蛋白和细胞凋亡过程发挥改善丙酸睾酮引起的大鼠BPH病理过程。

1叶挺宇,卢湧湧,潘悦,等.血府逐瘀汤加减联合西药治疗老年性前列腺增生的临床疗效〔J〕.中华中医药学刊,2014;32(12):2939-41.

2贺哲淳,杨晶,贺菊乔,等.前癃通胶囊对良性前列腺增生症前列腺体积影响的临床观察〔J〕.湖南中医药大学学报,2014;34(11):40-2.

3陈曦,史运迪,铁璐.Rho激酶(ROCK)在糖尿病并发症中的研究〔J〕.生理科学进展,2015;46(6):433-8.

4朱宏明,贾玲.辛伐他汀通过Rho/Rho激酶信号通路抑制高血压模型大鼠的心血管重构研究〔J〕.中国药房,2013;24(5):415-8.

5朱秀波.ROCK2 siRNA对自发性高血压大鼠勃起功能的影响〔D〕.泸州：泸州医学院,2014.

6潘恩山,李煜罡.益肾通胶囊治疗后BPH患者前列腺组织中促凋亡蛋白、抑凋亡蛋白的表达变化〔J〕.山东医药,2014；54(47):71-3.

7马增煌.A1蛋白与前列腺特异性抗原在前列腺癌与前列腺增生疾病中联合检测的意义〔J〕.实用老年医学,2014;28(1):49-51.

8方志启,吴刚,王贺彬,等.凋亡相关基因p53、bcl-2、bax在前列腺组织中的相关性〔J〕.中国临床解剖学杂志,2013;31(5):560-3.

9陈华,陈钧,杨学娟,等.水飞蓟宾磷脂复合物对大鼠自身免疫性前列腺炎炎性细胞因子的影响〔J〕.中国药房,2013;24(41):3873-5.

10何丽清,傅延龄,马艳红,等.当归贝母苦参煎剂对实验性慢性细菌性前列腺炎大鼠前列腺TNF-α的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012;18(2):212-4.

11孙国华,宁方霞,夏玉军.IL-10、TNF-α在前列腺增生及前列腺癌组织中的表达及意义〔J〕.泌尿外科杂志(电子版),2012;4(1):25-8.

12王磊,刘致中,杨磊,等.合并组织学炎症的前列腺增生组织中IL-6、TNF-α表达的研究〔J〕.临床泌尿外科杂志,2014;29(9):787-90.

〔2015-12-11修回〕

(编辑袁左鸣)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.005

河南省高校重点科研项目(No.16A350017)

王琳琳(1983-)，女，硕士，讲师，主要从事中药及活性成分药效学研究。

R285

A

1005-9202(2016)14-3359-04；