血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞增殖的影响及细胞因子信号转导抑制蛋白-1的干预作用

陈　锐　胡志希　聂海洋　张洪娜　胡志希

(长春中医药大学基础医学院，吉林　长春　130117)



血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞增殖的影响及细胞因子信号转导抑制蛋白-1的干预作用

陈锐胡志希1聂海洋2张洪娜3胡志希3

(长春中医药大学基础医学院，吉林长春130117)

目的探讨血管紧张素(Ang)Ⅱ对肾小球系膜细胞(HMC)增殖的影响及细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)-1的干预作用。方法体外培养HMC细胞，MTT法检测AngⅡ有效作用浓度，ELISA法检测白细胞介素(IL)-6、IL-1β的含量，Western印迹法测定肾组织SOCS-1表达，确定SOCS-1的干预作用。结果AngⅡ作用于HMC细胞后，吸光度值(OD值)明显增加(P<0.05)，10-6mol/ml AngⅡ在48 h作用最明显(P<0.01)。SOCS-1可以抑制HMC细胞增殖，降低IL-6和IL-1β水平，与AngⅡ组比较有显著性差异(P<0.01)。结论AngⅡ可诱导HMC细胞增殖，10-6mol/ml在48 h作用最明显；SOCS-1可以降低HMC细胞分泌IL-6和IL-1β的含量，抑制HMC细胞增殖，从而延缓与减轻肾小球硬化，减缓疾病进展。

SOCS-1；血管紧张素Ⅱ；肾小球系膜细胞；干预

糖尿病(DM)肾病(DN)是DM的严重并发症之一，也是导致死亡的重要原因；其微血管病变导致肾间质纤维化和肾小球硬化。肾小球系膜细胞(HMC)的过度增殖是导致肾间质纤维化及肾小球硬化的重要原因。研究表明，血管紧张素(Ang)Ⅱ破坏肾小管的生理平衡引发DN〔1〕，肾小球系膜细胞分泌大量白细胞介素(IL)-6和IL-1β，他们也是导致DN的主要因素〔2〕。因此，抑制HMC细胞的增殖和干预AngⅡ、IL-6、IL-1β的表达对于延缓与治疗DN意义重大。

1　材料与方法

1.1材料(1)细胞：人HMC(上海复祥生物)。(2)试剂：胰蛋白酶、AngⅡ、二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基、标准胎牛血清(Hyclone公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，北京鼎国昌盛生物公司)；兔抗细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)-1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；ELISA试剂盒(上海朗顿生物公司)

1.2主要实验仪器酶标仪(Rayto公司)；CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)；倒置荧光显微镜(上海比目仪器公司)；高速微能冷冻离心机3H24RI(湖南赫西)；精密电子天平(德国赛多利斯)；智能鼓风干燥箱DHG-9053A(上海和呈)；智能超净台(苏州净化)。

1.3方法

1.3.1AngⅡ有效作用浓度筛选HMC细胞在培养瓶中生长，长满后将其接种于96孔板中继续培养，培养箱CO2浓度为5%，培养温度为37℃。HMC于12 h后贴壁，更换培养液，24 h后细胞培育完成。分组：①对照组：正常HMC细胞组；②AngⅡ组：低浓度组10-8mol/ml，中浓度组10-7mol/ml，高浓度组10-6mol/ml；③空白调零组：无HMC细胞。反应时间分别为24、48 h，5 mg/ml的MTT 20 μl加入96孔板中，孵育于培养箱中，4 h后清除上清液。在96孔板中加入DMSO 150 μl，经10 min充分振荡，待其溶解充分后，记录波长492 nm下的酶标仪OD值。重复实验3次。

1.3.2SOCS-1抑制HMC细胞的增殖将实验分为6组:①对照组：正常培养细胞；②AngⅡ组：AngⅡ(10-6mol/ml)；③SOCS-1低剂量组(5 mg/ml，S1)+AngⅡ；④SOCS-1中剂量组(10 mg/ml，S2)+AngⅡ；⑤SOCS-1高剂量组(20 mg/ml，S3)+AngⅡ；⑥空白调零组：无HMC细胞。5%脱脂奶粉稀释兔抗体SOCS-1作用24、48 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl，在培养箱中孵育，4 h后清除上清液。同时计算出细胞生长抑制率。重复实验3次。

1.3.3ELISA法检测IL-6、IL-1β的含量实验分成6组，具体同1.3.2，严格按照说明书采用ELISA法进行IL-1β、IL-6含量的检测。

1.4统计学处理采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2　结　果

2.1AngⅡ对HMC细胞的诱导作用AngⅡ最佳诱导浓度为10-6mol/ml，作用48 h最明显(P<0.01)。见表1。

表1　AngⅡ对HMC细胞的最佳诱导浓度值)

与对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2SOCS-1有明显抑制AngⅡ诱导HMC细胞增殖的作用见表2。与AngⅡ组及对照组比较，S1、S2、S3组对HMC细胞的增殖均有明显抑制作用(P<0.01)，其中S3组48 h抑制效果最佳。

2.3SOCS-1明显抑制HMC细胞IL-6、IL-1β含量与AngⅡ组比较，SOCS-1三个剂量组均有抑制HMC细胞分泌IL-6、IL-1β的作用(P<0.01或P<0.05)。见表2。

表2　SOCS-1对AngⅡ诱导的HMC细胞增殖及细胞内IL-1β、IL-6水平的影响

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与AngⅡ组比较:3)P<0.01，4)P<0.05

3　讨　论

HMC细胞受炎症等多种因素刺激可异常增殖〔3〕。AngⅡ是血管收缩的活性物质，与肾小球系膜细胞受体结合，可促进IL-6、IL-1β等炎症因子分泌；炎性浸润、系膜细胞异常增值，导致肾脏纤维化及肾小球硬化〔4〕。实验研究表明，AngⅡ有明显促进大鼠肾小球系膜细胞显著增殖的作用〔5〕，因此本实验选用AngⅡ作为诱导刺激物有理论依据。实验研究显示，DN患者血浆中的IL-6、IL-1β等炎症因子明显高于正常人〔6～8〕。故控制HMC增殖、减少炎症因子分泌是防止、减缓肾小球硬化及纤维化的重要途径。

1张爱华，黄松明，丁桂霞,等.JNK-c-Jun/AP-1信号通路介导血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞增殖〔J〕.南京医科大学学报,2004;24(1):4-8.

2Nishimoto N,Kishimoto T.Anti-interleukin 6 receptor antibody treatment in rheumatic disease〔J〕.Ann Rheum Dis,2000;59(suppl1):121.

3司徒镇强.细胞培养〔M〕.北京:世界图书出版社,2004:246-50.

4Kim S.Molecular and cellular mechanisms of angiotensin Ⅱ mediated cardiovascular and renal disease〔J〕.Pharmacol Rev,2000;52(1):11-34.

5Wolf G,Ziyadeh FN.Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy〔J〕.Kindey Int,1999;56(2):393-405.

6Kolset SO,Reinholt FP,Jenssen T,etal.Diabetic nephropathy and extracellular matrix〔J〕.J Histochem Cytochem,2012;60(12):976-86.

7Demircan N,Safran BG,Soylu M,etal.Determination of vitreous interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor(TNF)levels in proliferative diabetic retinopathy〔J〕.Eye(Lond),2006;20(12):1366-9.

8唐爱华，周卫惠.肾康宁方对早期糖尿病肾病患者血清TNF-α及IGF-1的影响〔J〕.时珍国医国药,2013;24(11):2606-7.

〔2015-11-19修回〕

(编辑郭菁)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.003

国家自然科学基金(81374025)；湖南中医药大学中医诊断国家重点学科开放基金

胡志希(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中医心脑血管病证本质与证治规律研究。

陈锐(1973-)，女，博士，硕士生导师，副教授，主要从事中医临床教学与科研工作。

R587.2

A

1005-9202(2016)14-3355-02；

1湖南中医药大学2长春中医药大学附属第三临床医院

3北京中医医院顺义医院