土党参多糖对半乳糖联合三氯化铝致阿尔茨海默病小鼠脑损伤的影响

1　材料与方法

1.1动物SPF级KM小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2007-001。

1.2药材与试剂CJP由本课题组提供，多糖含量≥95%；考马斯亮蓝、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、乙酰胆碱(Ach)等试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器小鼠跳台记录仪(参照课题组专利自制)；Morris水迷宫改良自制(仿中国医学科学院药物研究所)；RM2235切片机(德国Leica 公司)；MD Spectra Max-190连续波长酶标仪(美国MD公司)。

1.4方法

1.4.1动物分组及给药KM小鼠120只，自由进食和饮水，适应性饲养7 d后随机分为空白组(Blank)、模型组(Model)、CJP高剂量(300 mg/kg，CJP-H)、中剂量(150 mg/kg，CJP-M)、低剂量组(75 mg/kg，CJP-L)，脑复康对照组(150 mg/kg，NFK)。药物用0.5%的CMC-Na配制，按小鼠体重0.2 ml/10 g于造模前3 d开始灌胃，空白组接受皮下注射相应的无菌生理盐水及灌胃生理盐水；CJP不同剂量组及阳性对照组灌胃给药3 d后，模型组及给药组早上皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)，间隔2 h后灌服生理盐水或者CJP，下午灌服三氯化铝(20 mg/kg)造成AD小鼠模型，连续造模10 w。

1.4.2行为学检查

1.4.2.1跳台法实验装置是10 cm×10 cm×50 cm小鼠跳台反应箱，分为5间，箱底是可通36 V电压连续刺激的铜栅。右后角置一直径和高均为4.5 cm的橡皮垫，作为小鼠回避电击的安全区。外置高清晰摄像头监控小鼠活动情况，记录实验结果。实验时先将小鼠置于跳台仪中，适应环境3 min，然后底部铜栅通以36 V、2 mA交流电，记录动物受到电刺激后跳上橡皮垫的反应时间和5 min内受到电击的次数(错误次数)作为学习成绩。24 h后将小鼠置于跳台仪中适应3 min，再将其置于橡皮垫上，记录第一次跳下橡皮垫的潜伏期和5 min受电击的次数(错误次数)作为学习成绩。

1.4.2.2暗箱法试验时，先将小鼠背朝洞口放入明室，同时开始计时和通电(36 V，2 mA交流电)，小鼠进入暗室立即遭到电击，记录小鼠受到电击的时间，以此作为学习成绩。24 h后记录小鼠第一次进入暗室的时间和5 min内的错误次数以此作为记忆成绩。

1.4.2.3Morris型水迷宫〔4〕实验前1～5 d让小鼠在Morris水迷宫中定向游泳。将安全台固定在标有东、南、西、北的任意一个位置不动，每天下午训练，每次随机取均分安全台对面半圆的5个点放入小鼠，记录小鼠入水时间和自入水到小鼠自行找到并爬上安全台所需时间作为潜伏期。爬上安全台后，让其在安全台上停留5 s。若小鼠120 s后还未找到安全台，则人为将小鼠引导上安全台停留5 s后，将小鼠从安全台上撤离下去休息，连续训练5 d。第6～7天进行空间探索实验，在定向游泳实验结束后，立即将安全台拆离，仍随机取5个入水点中的一个放入小鼠，计时小鼠在原安全台所在象限中停留的时间和经过原象限的次数，计算2 d平均值作为成绩。

1.4.3小鼠脑组织中指标检测小鼠Morris水迷宫实验结束后，立即处死小鼠并迅速取脑组织，称重，加入0.9%的冰冷生理盐水，制备成10%的脑匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液测定其中的SOD、MDA、NO、GSH、Ach等生化指标。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件行方差分析和t检验。

2　结　果

2.1CJP对AD脑损伤小鼠学习记忆障碍的影响与Model组〔(147.11±68.66)s〕比较，药物组〔CJP-L、CJP-M、CJP-H组分别为(237±105.95)s、(253±103.25)s、(255.65±93.47)s〕记忆潜伏期显著延长(P<0.01)。药物组在实验剂量范围内能较好改善小鼠的学习记忆障碍，与NFK组〔(248.02±116.31)s〕比较无统计学差异(P>0.05)。Blank组记忆潜伏期为(251.77±122.49)s。小鼠在经过连续5 d的Morris水迷宫训练后，游泳时间(学习记忆潜伏期)呈现出递减规律。Model组小鼠潜伏期变化不大，其他组的潜伏期显著缩短。见图1。在第3天，Model组定向航行时间显著高于Blank组、药物组、NFK组，说明药物可提高学习记忆能力。第6、7天撤去平，结果Blank组、药物组和NFK组小鼠经过原象限的时间和次数与Model组相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。见表1。

图1　各组小鼠Morris水迷宫定向航行的逃避潜伏期

组别剂量(mg/kg)时间(s)次数Blank组042.73±7.893.22±0.973)Model组026.99±7.111)1.40±0.371)CJP-L组7537.17±10.052)3.30±1.103)CJP-M组15038.18±4.802)3.58±1.673)CJP-H组30039.37±7.032)3.82±1.393)NFK10041.30±17.013)3.60±2.113)

与Blank组比较：1)P<0.01；与Model组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2CJP对AD小鼠脑组织中相关指标的影响与Blank组比较，Model组小鼠大脑组织中MDA、NO增高，而GSH、SOD含量降低，但除了SOD含量差异有统计学意义(P<0.05)以外，其他指标差异不显著。与Model组相比，CJP 3个剂量组MDA、NO含量降低，GSH、SOD含量增加，其中CJP-M、-H组MDA和SOD含量差异有统计学意义(P<0.05)。造模70 d后，CJP-H组小鼠脑组织Ach含量接近正常值，CJP-L组尚未回升至正常水平(P<0.05)。见表2。

表2　CJP对小鼠大脑组织生化指标的影响

与Blank组比较：1)P<0.05；与Model组比较：2)P<0.05

3　讨　论

有学者报道D-半乳糖和三氯化铝制作的多重复制AD小鼠模型能导致小鼠记忆减退、皮质和海马产生老年斑等AD样症状〔5〕，成本低廉。AD一般发生在老年人群中，年龄增长是发病的一大危险因素，可通过对成年小鼠注射半乳糖，造成亚急性衰老模型模拟AD发病特点〔6〕。三氯化铝超过正常摄入量可导致动物行为异常，如食欲下降、反应迟钝、行动迟缓、学习记忆能力下降；同时，破坏胆碱能神经功能，还可增强β-分泌酶和γ-分泌酶活性，增加淀粉样蛋白的产量。铝摄入过量而积聚可使反应性星形胶质细胞被激活引发炎性级联反应，促使其以不溶性形式沉积于脑组织，形成老年斑〔7,8〕。

关于AD 的发病机制，目前比较认可的假说为氧化应激假说、自由基损伤假说、能量代谢假说、淀粉样蛋白级联反应假说以及胆碱能假说等〔9〕。AD患者体内SOD 和MDA 水平变化情况，可作为临床上诊断AD的主要方法〔10〕。Ach是脑内重要的神经递质，胆碱能系统对机体维持正常的认知功能发挥重要作用。Ach在皮质和海马的缺失将导致学习记忆认知功能显著降低〔11〕。研究发现，增加认知障碍患者海马Ach 浓度后，认知和空间记忆功能均得到改善〔12〕。本研究显示，CJP对SOD、MDA、Ach的影响比较明显。

1杨小生,张占军,杨再昌,等.土党参多糖、衍生物及其制备方法和应用:中国200510200024.2〔P〕.2007-09-12

2张振东,杨娟,吴兰芳,等.土党参多糖对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国药理学通报,2011;27(4):508-11.

3Scali C,Prosperi C,Vannucchi MG,etal.Brain inflammatory reaction in an animal model of neuronal degeneration and its modulation by an anti-inflammatory drug:Implication in Alzheimer's disease〔J〕.Eur J Neurosci,2000;12(6):1900-12.

4黄忠仕,焦杨,张士军,等.龙眼参多糖对老年痴呆模型SAMP8小鼠学习记忆的改善作用〔J〕.中国老年学杂志,2008;28(21):2086-8.

5罗焕敏,肖飞.D-半乳糖和三氯化铝诱导小鼠产生类阿尔茨海默病变〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2004;18(1):22-6.

6Wang W,Li S,Dong HP,etal.Differential impairment of spatial and nonspatial cognition in a mouse model of brain aging〔J〕.Life Sci,2009;85(3-4):127-35.

7Rao KSJ，Anitha S，Latha KS.Aluminium-induced neurodegeneration in the hippocampus of aged rabbits mimics Alzheimer's disease〔J〕.Alzheimer Rep，2000;3(2):83-8.

8赵宪林,季东培,方秀斌,等.血管性痴呆大鼠海马神经元超微结构的研究〔J〕.解剖科学进展,2000;6(2):161-3.

9Christian B.Alzheimer's disease and oxidative stress:implication for novel therapeutic approaches〔J〕.Prog Neurobiol,1999;57(3):301-23.

10Cahill JF,Baxter MG.Cholinergic and noncholinergic septal neurons modulate strategy election in spatial learning〔J〕.Eur J Neurosci,2011;14:1856-64.

11Gron G,Brandenburg I,Wunderlich AP,etal.Inhibition of hippocampal function in mild cognitive impairment:targeting the cholinergic hypothesis〔J〕.Neurobiol Aging,2009;27:37-45.

12Steiner JP,Hamilton GS,Ross DT,etal.Neurotrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in neurodegenerative animal models〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(5):2019-24.

〔2015-11-20修回〕

(编辑郭菁)

The effect of Campanumoea javanica polysaccharide on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride

ZHANG Zheng-Dong,PENG Mei,YANG Juan.

Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of Campanumoea javanica polysaccharide(CJP)on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride.MethodsThe nervous system of mice were damaged by subcutaneous injection of D-galactose and intragastric administration of AlCl3.The effects of CJP on brain damage in mice were studied,including the observation of learning and memory performance,the contents of malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO),glutathione(GSH)and acetylcholine(Ach).ResultsCompared with model group,CJP improved the learning and memory abilities,increase the contents of GSH and SOD in brain,while decrease the contents of NO and MDA.ConclusionsCJP has certain effect on brain injury induced by D-galactose combined with aluminum chloride.

Campanumoea javanica polysaccharide;D-galactose;Aluminium chloride;Brain injury

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.002

国家自然科学基金资助课题(No.81160513)

杨娟(1971-)，女，研究员，博士，硕士生导师，主要从事天然药物研究。

张振东(1982-)，男，中级工程师，硕士，主要从事食品质量与安全研究。

R741

1005-9202(2016)14-3353-03；

1阜阳市食品药品监督管理局

土党参多糖对半乳糖联合三氯化铝致阿尔茨海默病小鼠脑损伤的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

1　材料与方法

2　结　果

3　讨　论