系统组织工程技术优化的正丁胺含量离子色谱检测

谢红英，雍智全2，王梦丽，冯亚男，孙嘉茵，李宇茜，徐小平

（1.四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2.东莞达信生物科技有限公司，广东 东莞 523808）

系统组织工程技术优化的正丁胺含量离子色谱检测

谢红英1，雍智全2，王梦丽1，冯亚男1，孙嘉茵1，李宇茜1，徐小平1

（1.四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2.东莞达信生物科技有限公司，广东 东莞 523808）

该文采用系统组织工程技术（ZTSO）快速优化并建立正丁胺含量测定的离子色谱法。选用AcelaimTMTrinityTMP1（3.0mm×100mm，3μm）为色谱柱，18mmol/L乙酸铵（用乙酸调pH 3.4）∶乙腈（56∶44，ν∶ν）为淋洗液，在柱温37℃，流量0.15 mL/min的条件下等度洗脱，电导检测器检测，20min内完成正丁胺的含量测定。结果表明：正丁胺质量浓度在10.01～500.5 μg/mL范围内线性关系良好（r2=0.999 8），检测限为5.05 μg/mL（S/N≥3），定量限为10.01 μg/mL （S/N≥10），日内和日间精密度分为0.33%和0.90%，正丁胺供试品溶液在24h内稳定（RSD=0.54%），3批正丁胺原料的平均含量为99.79%（RSD=0.125%），3批肿瘤血管抑制剂XY03中正丁胺的平均含量为20.32%（RSD=4.09%），热干燥时，XY03中铵盐的下降率与其溶解度呈正相关。ZTSO技术具有较好的条件优化功能，所建立的方法快速、简便和准确，是正丁胺或含正丁铵盐化合物含量测定的较好方法。

正丁胺；离子色谱法；含量测定；系统组织工程技术

0　引　言

ZTSO系统组织工程技术是世界首创的集“试验设计”与“数据决策”于一体的系统优化技术，它以数学、系统论、控制论、协同学、开放系统耗散结构理论等为基础，以最少量的实验数据快速整理出符合组织规划的优化系统，使系统表现出最大的效能［1］。正丁胺是一种常见的小分子有机胺，广泛用于化工和制药业。药物研究中利用其毒性低、安全性较好（LD50≥500mg/kg）且具有碱性并与有机酸成盐的性质，可改善不溶性有机酸类药物的水溶性，提高药物的生物利用度。本文所涉及的创新肿瘤血管抑制剂XY03［2］即是利用了CA4酸与正丁胺成盐后，水溶性改善，使不溶性的CA4酸的溶解度提高至20%，提高了抗癌药XY03体内吸收，扩大了药品制剂的给药途径。然而，极性较大的小分子有机胺-正丁胺是色谱分离分析的难点，目前检测中主要采用气相色谱法（GC）［3］和气相色谱/质谱（GC/MS）联用技术［4］，色谱峰多严重拖尾，同时检测灵敏度也偏低。若采用衍生化去极性，或者采用低极性柱或碱性柱来克服拖尾问题，又将引入更多误差。高效液相色谱法（HPLC）分离，也因有机胺的保留较差，难与溶剂峰分离且多无紫外吸收受到限制［5］。随着离子色谱仪的普及，现在多采用离子色谱法对不同样品中的小分子胺［6-10］、有机酸［11］、多糖［9］和内源性代谢胺［12-13］等进行分析，但针对正丁胺及含正丁铵盐化合物中正丁胺（铵）的定量检测方法及其评价还少有涉及。所以，本文采用离子色谱法分离，以电导检测器检测正丁胺，并采用ZTSO技术快速优化分离条件，建立并评价快速分离测定正丁胺含量的方法并应用于肿瘤血管抑制剂XY03的原料正丁胺和XY03的质量研究。

表1　参数边界分布表

表2　不同预设试验方案

表3　不同试验方案下的色谱行为结果

1　实验部分

1.1仪器、技术与试剂

仪器：CIC-D160盛瀚离子色谱仪 （山东青岛离子色谱科技有限公司）；品成纯水器（成都品成科技有限公司）；BT 125D电子天平（德国赛多利斯公司）。

试剂：分析纯乙酸铵（天津市科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈（广东光华科技有限公司）；正丁胺（成都市科龙化工试剂厂）；超纯水（自制）；XYO3供试品（自制）。

ZTSO系统组织工程技术（成都万维优方科技有限公司提供）。

1.2溶液的制备

1.2.1对照品溶液

精密称取正丁胺约20mg，加流动相溶解并稀释成质量浓度为200μg/mL溶液，作为对照品溶液。

1.2.2供试品溶液

精密称取正丁胺约20mg，加流动相溶解并稀释成质量浓度200μg/mL的溶液，作为正丁胺供试品溶液。另取XY03供试品粉末10mg，精密称定，加流动相溶解并稀释成500μg/mL的溶液，作为XY03的供试品溶液。

1.3色谱条件的优化

ZTSO系统组化技术将以较少的探测实验，提供影响参数与分离和柱效的关系，再经计算获得最佳分离条件，每次试验3个方案，通过2～3轮实验获得相关结果，如表1和表2所示。

1.4色谱条件

按表1设置边界参数，利用ZTSO设计第1次优化的3项试验，并根据其结果设计第2次优化的3项试验，得到如表3所示第2次结果。综合表中参数，确定第6项试验中色谱条件为最终条件。色谱柱：AcelaimTMTrinityTMP1（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流动相：18mmol/L乙酸铵（用乙酸调pH 3.4）∶乙腈（56∶44，ν∶ν）；检测器：电导检测器；柱温：37℃；流量：0.15mL/ min；进样量：25μL；进样浓度：200μg/mL。对照品溶液连续进样6次，正丁胺峰面积的相对标准偏差（RSD）不得大于2.0，保留时间是14.14min。

图1　ZTSO技术优化正丁胺离子色谱前后的色谱图

1.5方法学考察

1.5.1专属性

分别将XYO3供试品溶液于高温120℃破坏1 h、加1mol/L盐酸破坏2h，加10%H2O2氧化2h进行破坏，破坏后的供试品溶液经1.4项色谱条件分离，破坏出的杂质均不影响正丁胺主成分峰的分离，说明所建立的色谱条件具有良好的专属性。

1.5.2线性、检出限和定量限

精密量取正丁胺对照品储备液适量，分别置于10 mL容量瓶中，加水稀释制成7个不同质量浓度（10.01，20.02，50.5，100.1，200.2，400.4，500.5 μg/mL）的标准溶液，按照1.4下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。以质量浓度与峰面积回归计算正丁胺的标准曲线和相关系数，得到线性回归方程式为y=1 142x+634.4，相关系数为0.9998，见图2，表明正丁胺在10.01～500.5 μg/mL范围内线性关系良好。检测限为5.05 μg/mL（S/N≥3），定量限10.01 μg/mL （S/N≥10）。

图2　正丁胺的标准曲线

1.5.3精密度

取正丁胺对照品溶液，按1.4下条件，连续重复进样6次，测定峰面积，按峰面积计算进样精密度为0.33%；取同一批XY03样品6份，按照1.2.2制成供试品溶液，按外标法测定被测组分含量，按含量计算重复性精密度为1.21%；分别于6d内，按照外标法每天测定XY03样品中正丁胺的含量，其含量日间精密度为0.90%。

1.5.4溶液稳定性

精密称取一份XY03样品，按照1.2.2配制XY03供试品溶液，放置24 h，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样，按照外标法计算含量，得样品在24 h内正丁胺的含量RSD为0.54%，表明该样品溶液在室温条件下稳定。

1.5.53批正丁胺和XY03小试的正丁胺含量

分别取3批正丁胺及XY03样品，按照1.2.2配制供试品溶液，进样，按照外标法计算含量，结果见表4。

表4　3批正丁胺原料和XY03中正丁胺的含量（x±RSD，n=6）

1.5.6XY03干燥时间对正丁胺含量的影响

取XY03供试品粉末适量，置于培养皿中，40℃的烘箱加热干燥，分别于0.5，1，2，4，8，12h取样适量，按照1.2.2项下制备XY03供试品溶液，照1.4项下色谱条件分离测定，外标法计算正丁胺的含量，结果见表5。

表5　XY03在不同干燥时间正丁胺含量的下降率和XY03溶解度下降率

2讨　论

2.1ZTSO系统组织工程技术的特点

若本文采用单因素实验，则按照每一个因素最少3次试验，5个因素至少要做15个试验，如果因素再多或者水平再增加，那么试验的次数还会几何增长，且不一定获得最佳条件；但是，采用ZTSO技术，只需6次，最多不超过10次试验，即能优化出最佳条件，使柱效从最初的理论搭板数（1396）上升至3638，大大缩短色谱条件的筛选时间。

2.2正丁胺分离中淋洗液的影响特点

正丁胺的离子色谱法分离具有一定难度，由于分子量相对于甲胺、乙胺等较大，同时极性均较强，当采用阳离子交换柱时，所用的强酸淋洗液对阳离子铵盐的洗脱也有所不同。实验表明，不同强酸淋洗液对柱效的贡献顺序分别为5.5mmol/L苯磺酸（n=589；T=1.21）+5.5mmol/L硝酸（n=693，T=3.23）＜5.5mmol/L苯磺酸+10%乙腈（n=935，T=2.84）＜10 mmol/L盐酸 （n=1 084，T=1.39）＜5.5 mmol/L苯磺酸+20%乙腈（n=1 346，T=1.98）＜5.5mmol/L邻苯二甲酸（n=1488，T=1.87）。即便如此，采用阳离子柱分离小分子胺时，淋洗液的酸度有助于有机胺的柱效升高和拖尾改善，但柱效的升高远未达到要求，其原因还是铵离子的极性太强，与固定相阴阳离子结合过于牢固。当适当添加一定量的乙腈改性时，有利于正丁胺的柱效改善，推测与作用有机胺的有机部分关联。此外，需考察不同色谱柱对分离效果的影响 （如图3所示），单纯采用C18柱，极性较高的正丁胺几乎无保留，与溶剂峰难以分离；当采用阳离子柱分离时，正丁胺表现出较严重的拖尾，且峰宽较大，淋洗液洗脱较困难，柱效难以突破2 000，分析原因为固定相中磺酸基的阴离子与铵阳离子的结合较强。当采用两性离子色谱柱AcelaimTMTrinityTMP1柱时，由于固定相为硅胶基质，并采用了纳米聚合物硅胶混合技术（NSH），柱填料表面提供多种保留机制，同时具有反相（RP）、阴离子交换、阳离子交换能力，从而减轻了对铵离子的保留能力；所以，柱效有明显改善。加之通过ZTSO优化，最终获得3 600以上的柱效，满足试验要求。

图3　不同色谱柱的分离组合图

3　结束语

本文采用ZTSO优化的离子色谱检测XY03及正丁胺原料中正丁胺含量，并考察了XY03中铵盐含量与其溶解度的关系，结果表明XY03的铵盐基的下降与XY03的溶解度下降呈正相关，并且随着干燥时间的延长，铵盐分解加重，XY03的溶解度下降加重，证明了XY03中铵盐的热不稳定性。

综上，ZTSO系统组织工程技术具有较好的色谱条件快速优化作用；本法快速、简便、稳定和准确，可用于XY03及其原料正丁胺的定量分析。

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（编辑：莫婕）

Ion chromatography determination of n-butylamine content based on ZTSO optimization

XIE Hongying1，YONG Zhiquan2，WANG Mengli1，FENG Ya'nan1，SUN Jiayin1，LI Yuqian1，XU Xiaoping1
（1.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Dongguan Daxin Biotech Co.，Ltd.，Dongguan 523808，China）

Zhang's technique system organization（ZTSO）has been rapidly optimized and ion chromatography determination of n-butylamine content has been established.AcelaimTMTrinityTMP1 （3.0 mm×100 mm，3 μm）was adopted as chromatographic column.The leacheate was 18 mmol/L ammonium acetate（adjust pH 3.4 by using acetic acid）-acetonitrile（56∶44，ν∶ν），and the detector was conductivity detector.Under the condition of 37℃ column temperature and isocratic elution at a flow rate of 0.15 mL/min，the measurement of n-butylamine content could be done in 20 minutes. Show that there was a good linear relationship（r2=0.9998）at range of the concentration of 10.01-500.5μg/mL，the limit of detection is 5.05μg/mL（S/N≥3），the limit of quantization is 10.01μg/mL （S/N≥10），the intra-day and the inter-day precision were at 0.33%and 0.90%respectively，nbutylamine solution was stable（RSD=0.54%）in 24 hours.The average content of n-butylamine raw materials in three batches are 99.79%（RSD=0.125%），the average n-butylamine content is 20.32%（RSD=4.09%）in three batches of tumor angiogenesis inhibitors XY03.When heat drying，the decrease rate of ammonium salt in XY03 was positively related to its solubility.ZTSO technology has good conditions for optimizing function.The method is rapid，simple and accurate，which is a better method for the assay of n-butylamine or containing the butyl ammonium of compounds.

n-butylamine；ion chromatography；content assay；ZTSO

A

1674-5124（2016）07-0035-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.07.007

2015-12-27；

2016-01-15

谢红英（1991-），女，四川成都市人，硕士研究生，专业方向为药物质量控制。

徐小平（1962-），男，四川成都市人，副教授，硕士生导师，主要从事药品质量控制和药物代谢分析研究。