肺炎克雷伯菌分离株的耐药性与毒力基因分布及相互关系研究*

赵瑞珂，李艳萌，2，顾国浩，韩清珍，赵丽娜，钱雪峰，张险峰，史进方，徐　杰△

(1.苏州大学附属第一医院检验科　215006；2.山东省日照市人民医院检验科　276826)



肺炎克雷伯菌分离株的耐药性与毒力基因分布及相互关系研究*

赵瑞珂1，李艳萌1，2，顾国浩1，韩清珍1，赵丽娜1，钱雪峰1，张险峰1，史进方1，徐杰1△

(1.苏州大学附属第一医院检验科215006；2.山东省日照市人民医院检验科276826)

目的研究肺炎克雷伯菌的耐药性与毒力基因的分布及二者间的关系，为临床合理使用抗菌药物和控制感染提供依据。方法分离出172株肺炎克雷伯菌，采用纸片扩散法(K-B法)做药物敏感试验；聚合酶链反应(PCR)检测rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因。结果172株肺炎克雷伯菌分离株对头孢菌素类头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟与头孢曲松的耐药率分别为38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因的阳性率分别为49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。肺炎克雷伯菌毒力基因分布与耐药性呈负相关，差异有统计学意义(P<0.01)。结论肺炎克雷伯菌毒力基因数与耐药性密切相关，临床应注意抗菌药物的合理应用，防止肺炎克雷伯菌耐药性的产生和传播。

肺炎克雷伯菌；毒力基因；耐药性

肺炎克雷伯菌是医院感染常见的细菌，主要引起免疫力低下患者的各种感染，如原发性肺炎，存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，造成肺炎[1]。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物耐药的重要原因。ESBLs基因多有质粒介导，而这些质粒常同时携带氨基糖苷钝化酶、ampC酶、喹诺酮类等药物的耐药基因，表现出多重耐药、交叉耐药。近年来随着广谱抗菌药物的不规范使用，多重耐药的肺炎克雷伯菌检出率不断上升，这给临床的治疗带来了很大的难题。

为了解肺炎克雷伯菌的耐药性与致病性及二者间的关系，本研究对临床分离的172株肺炎克雷伯菌进行耐药性与毒力基因的分析，了解其耐药谱和毒力基因分布，并分析二者间的关系，为临床由肺炎克雷伯菌引起感染的治疗提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源选择2013年10月至2014年9月苏州大学附属第一医院住院患者分离出的肺炎克雷伯菌，共172株。同一患者同类标本同一时期分离到的同种菌株不重复计入。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。

1.1.2鉴定与药敏分离出的细菌均经法国Bio-Merieux公司VITEK Ⅱ Compact鉴定，保存于-70 ℃。有效期内用于抗菌药物体外敏感试验的药物敏感试验纸片：复方磺胺、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、环丙沙星、亚胺培南，均购自英国Oxoid公司。

1.2方法

1.2.1药敏试验采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验，结果参照2011版美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准，对172株肺炎克雷伯菌分离株进行药物敏感性判定。产ESBLs肺炎克雷伯菌用聚合酶链反应(PCR)法检测SHV、TEM、CTX-M、OXAs基因确定。将耐一种抗菌药物的简称为“耐药模式一”，耐两种抗菌药物的简称为“耐药模式二”，以此类推分析172株菌株的耐药模式。

1.2.2DNA模板的制备水煮法制备DNA模板，99 ℃煮10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板，-20 ℃放置备用。

1.2.3PCR反应体系及条件反应体系为25 μL：2.5 μL的10× PCR buffer、1 U的Taq聚合酶、0.5 μL的上下游引物(20 μM)、2 μL的DNA基因组模板，ddH2O定容至25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃ 延伸10 min；4 ℃ forever。根据参考文献[1]设计rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG基因的引物，引物均由华大基因有限公司合成。120 V恒压琼脂糖凝胶电泳，PCR产物根据条带长度进行判定。

1.3统计学处理应用SPSS 21.0进行统计分析，菌株耐药统计分析时设定为“1”，敏感设定为“0”；毒力基因有为“1”，无为“0”， ESBLs组与非ESBLs组比较均值做独立样本t检验。利用SPSS 21.0软件双变量相关性分析，对分离株的多种药耐药率和毒力基因数关系进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1肺炎克雷伯菌对15种常见抗菌药物药敏检测结果头孢菌素类头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟与头孢曲松的耐药率依次为38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南的耐药率非常低(<15%)，见表1。肺炎克雷伯菌多重耐药模式分析发现，耐3种以上抗菌药物的百分率为37.2%，而且其多重耐药谱主要集中于青霉素类、头孢类、氟喹诺酮类为基础的不同组合。全敏感菌株和“耐药模式一”的构成比为55.8%，这说明大部分菌株对15种抗菌药物较为敏感，见表2。

2.2肺炎克雷伯菌分离株毒力基因分布比较分析毒力基因在172株肺炎克雷伯菌株中的分布，结果显示，毒力基因rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG的阳性率分别为49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。ESBLs与非ESBLs肺炎克雷伯菌株间毒力基因检出率差异有统计学意义(P<0.05)。毒力基因在172株肺炎克雷伯菌中分布见表2。另外，172株肺炎克雷伯菌中含有一种毒力基因或多种毒力基因，其分布构成比见表3。

2.3毒力基因分布与耐药性之间的关系毒力基因数与耐药性间的相关系数为-0.521，呈负相关，在P=0.01水平(双侧)上显著相关。也就是说，毒力基因分布数越多的菌株，多重耐药现象出现的概率就越小。

表1　　172株肺炎克雷伯菌分离株的耐药率[n(%)]

表2　　172株肺炎克雷伯菌不同毒力基因的分布率[n(%)]

表3　　肺炎克雷伯菌中毒力基因构成比[n(%)]

3　讨　　论

随着高级别头孢类抗菌药物的大量使用，肺炎克雷伯菌对其耐药率在逐年上升，这可能与其产ESBLs耐药机制有关。本研究对172株肺炎克雷伯菌临床分离株进行多重耐药谱分析发现，耐3种及以上抗菌药物的多重耐药率达可达37.2%，而且其多重耐药谱主要集中于哌拉西林(青霉素类)、头孢类、庆大霉素、环丙沙星(氟喹诺酮类)等为基础的不同组合。全敏感菌株和“耐药模式一”的构成比为55.8%，这说明大部分菌株对15种抗菌药物较为敏感，可见肺炎克雷伯菌的耐药并未出现大肠埃希菌的多重耐药现象。

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的重要条件致病菌，常引起社区获得性肺炎或医院内感染肺炎。肺炎克雷伯菌具有一些重要的毒力基因，其编码蛋白在肺炎克雷伯菌与宿主间的侵袭、黏附、定植、抗吞噬等环节发挥重要作用，例如荚膜抗原、菌毛、抗血清杀菌活性和脂多糖、含铁细胞相关的基因。magA基因编码一种外膜蛋白，它参与肺炎克雷伯菌的保护性表多糖网络的形成，并且其表达可致原发性肝脓肿以及转移性的脓毒性并发症[2]，而rmpA基因被180-kb质粒编码，它的表达控制着类黏蛋白的表型以及荚膜黏多糖的产生，这正是肺炎克雷伯菌能在体内外试验中保持抗吞噬能力的关键[3-4]。magA、rmpA基因的表达与高黏液表型形成密切相关[5]。Ybt可以使细菌菌体在呼吸道定植并通过规避Lcn2引起肺炎，亦是肺炎克雷伯菌的一个重要的致病因子[6]。Holt等[7]对300株肺炎克雷伯菌的全基因组测序和泛基因组数据分析研究发现，引起社区侵袭性感染的肺炎克雷伯菌与特定的毒力基因谱有关；与非侵袭性感染和携带的肺炎克雷伯菌相比，侵袭性肺炎克雷伯菌有rmpA、rmpA2和铁摄取基因簇显著相关。本研究结果显示，肺炎克雷伯菌rmpA、aer-1、gyrB、ybt基因检出率非常高，肺炎克雷伯菌临床分离株携带多种毒力因子，通过其功能发挥引起相关感染。

毒力与耐药是细菌两个重要致病性因素，在感染中发挥重要作用。本研究毒力基因分布数与耐药性相关分析发现，毒力基因数与耐药性之间呈显著负相关，越是耐药的菌株，其携带的毒力基因个数越少；越是敏感的菌株，其携带的毒力基因个数越多。毒力基因数与耐药性间呈负相关与本研究对尿路致病性大肠埃希菌毒力与耐药性的研究结果相一致[8]；同时Shin等[9]的研究结论也和本研究结果相一致，即药敏越敏感的菌株其致病性越强。Shin等[9]对产CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌基因型和毒力特征比较分析发现，产CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌没有发生耐药质粒从耐药菌株往敏感菌株转移的现象；产CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌的ST基因型不同，CTX-M某一基因型在医院获得性感染中占优势更倾向于用某一ST型的暴发来解释，因此控制多重耐药产ESBLs肺炎克雷伯菌的传播对于医院感染控制工作尤为重要。本研究中毒力基因数与耐药性负相关的结果表明，毒力的获得与丢失和耐药性的获得与丢失间存在一定的关系。但是，有关毒力与耐药之间的作用关系，还有待进一步深入探讨。

综上所述，肺炎克雷伯菌分离株对大多常见抗菌药物表现为敏感，产ESBLs酶的菌株仅占24.4%，但临床要重点关注与监测头孢类抗菌药物使用选择压力下肺炎克雷伯菌获得携带ESBLs基因的相关质粒，及耐药性产生、变迁与抗菌药物使用变化间的关系。肺炎克雷伯菌分离株中存在大量与细菌荚膜形成、脂多糖合成、黏液型、抗吞噬、铁获取相关的毒力基因，如magA、rmpA、aerA、ybt基因。因此，医院要关注和加强肺炎克雷伯菌的耐药与毒力基因携带情况的监测，规范合理使用抗菌药物，防止耐药菌株的产生和传播。

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江苏省卫生厅医学科研项目(Q201401)；江苏省研究生培养创新工程项目(KYLX-1261)；苏州市“科教兴卫”青年课题项目(kjxw2014008)。作者简介：赵瑞珂(1986-)，在读硕士，主要从事临床细菌耐药与致病机制研究。△

，E-mail:xuj2007@lzu.edu.cn。

R978.1

B

1671-8348(2016)20-2820-04

2016-02-18

2016-04-09)

·经验交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.027