忽地笑γ-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

蔡黎丽, 徐　晟, 马　蕊, 汪　仁, 夏　冰,①

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京210014； 2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 江苏 南京210014〕



忽地笑γ-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

蔡黎丽1,2, 徐晟1, 马蕊1, 汪仁1,2, 夏冰1,2,①

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京210014； 2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 江苏 南京210014〕

采用RACE技术从忽地笑〔Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.〕叶片中克隆获得γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因，命名为LaTMT。序列分析结果显示：该基因cDNA全长1 458 bp，其中开放阅读框(ORF)长1 017 bp，编码338个氨基酸残基。LaTMT基因编码蛋白质的理论相对分子质量37 560，理论等电点pI 8.70，为亲水性蛋白，无跨膜结构但具有信号肽结构；并具有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基转移酶保守结构域，包含3个SAM结合位点；该蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。序列比对和系统进化树分析结果显示：LaTMT蛋白属于S-腺苷甲硫氨酸-依赖性γ-生育酚甲基转移酶家族，与其他植物γ-TMT蛋白的一致性为64%～75%；在NJ系统树上，LaTMT蛋白与单子叶植物γ-TMT蛋白聚为同一大类，并与油棕(ElaeisguineensisJacq.)EgTMT和美洲油棕〔Elaeisoleifera(Kunth) Cortés〕EoTMT聚为同一类，亲缘关系最近。基因表达分析结果显示：LaTMT基因可在大肠杆菌中成功表达，且表达量随异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导时间的延长而增加；在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中LaTMT基因均可表达，其中在叶片中的相对表达量最高，在子房、雄蕊和鳞茎中的相对表达量相对较低，具有明显的组织特异性。研究结果表明：忽地笑LaTMT基因在进化过程中具有很高的保守性；该基因主要定位于叶绿体中，并与忽地笑对非生物逆境胁迫的抗性相关。

忽地笑;γ-生育酚甲基转移酶基因; 基因克隆; 序列分析; 表达分析

维生素E(VE)是维持人类和动物生长、繁殖所必需的重要物质，在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用[1-3]。植物中的VE通常在光合器官中合成和积累，植物中合成的VE包括生育酚(tocopherol)和生育三烯酚(tocotrienol)，根据其芳香环上甲基的位置和数目的不同，还可分为α、β、γ和δ4种[4]，其中α-生育酚的活性最高。

VE在合成过程中首先生成γ和δ型，然后在γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的催化作用下分别生成α和β型[5-6]，并且α和β型VE活性较高，因此，γ-TMT是决定植物中VE成分和活性的关键酶。目前，研究者已对多种植物的γ-TMT基因进行了克隆和表达分析，例如，过量表达拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕的γ-TMT基因，可使其叶片中α-生育酚的比例从87.5%提高到97.1%[7]；过量表达芥菜〔Brassicajuncea(Linn.) Czern.〕的γ-TMT基因，可使其叶片中α-生育酚的含量提高6倍[8]。因此，克隆不同物种的γ-TMT基因并进行深入研究对改良植物VE的品质和性状具有重要意义。

忽地笑〔Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.〕是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(LycorisHerb.)多年生草本植物，具有重要的观赏和药用价值。目前，已从忽地笑鳞茎中提取获得包括加兰他敏(galanthamine)在内的多种石蒜科生物碱，临床上用于治疗阿尔茨海默氏病和小儿麻痹症等疾病[9]。作者所在课题组根据忽地笑的转录组测序结果，从中筛选了部分可能参与忽地笑体内加兰他敏生物合成的相关基因片段[10]。

在上述研究的基础上，本课题组获得了N甲基转移酶(NMT)候选基因片段，且利用RACE技术克隆得到1个忽地笑γ-生育酚甲基转移酶基因，并对其进行相关的生物信息学分析和原核表达等研究，以期为石蒜属植物功能基因的合理开发奠定研究基础，并为药用植物资源的深度利用提供实验数据。

1　材料和方法

1.1材料

供试多年生忽地笑叶片采自江苏省中国科学院植物研究所试验场。

原核表达载体pET28a、大肠杆菌菌株TOP10和BL21为本实验室保存；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司；T4DNA连接酶、pMD19-T载体、反转录酶M-MLV(RNase H-)、LA-TaqDNA聚合酶、限制性内切酶及实时荧光定量PCR试剂盒SYBRPremixExTaqTMⅡ购自宝生物工程(大连)有限公司；植物RNA提取试剂Trizol、10×PCR buffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs mixture和DL2000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购于上海浦迪生物科技有限公司。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；由南京伯津生物技术有限公司进行测序。

1.2方法

1.2.1叶片总RNA的提取参照植物RNA提取试剂说明书，称取盛叶期的忽地笑单株嫩叶约0.2 g，于液氮中充分研磨， 加入1 mL Trizol振荡混匀后放置5 min；加入0.2 mL三氯甲烷，振荡15 s，并静置2～3 min，12 000g离心15 min；取上层水相，加入2倍体积无水乙醇，于-20 ℃静置30 min， 12 000g离心10 min； 沉淀用1 mL体积分数75%乙醇洗涤2遍，然后用RNase-free水溶解，最后用质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及完整性。

1.2.2全长cDNA的克隆和测序根据忽地笑转录组数据库，选择注释为γ-TMT的基因片段，设计5′-端序列和3′-端序列的扩增引物(表1)。RACE扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s、52 ℃退火25 s、72 ℃延伸50 s，共38个循环。产物经质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，用回收试剂盒回收片段；连接pMD19-T载体，并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；经PCR验证后，挑取阳性克隆子进行测序。

用Vetor NTI软件对测序结果进行分析，并根据扩增片段的重叠部分对已知基因片段序列、5′-端扩增片段序列和3′-端扩增片段序列进行拼接，得到该基因的全长cDNA序列；随后用在线软件ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)找出开放阅读框(ORF)，根据pET28a载体图设计带有酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物LaTMT-pETR和LaTMT-pETF(表1)；接着用LA-TaqDNA聚合酶进行PCR，扩增其编码区序列，具体PCR扩增程序参照文献[11]。回收PCR扩增目标产物并连接pMD19-T载体，构建重组质粒pMD-LaTMT，随后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；经PCR验证后，挑取阳性克隆子进行测序，保留测序正确的菌液。

表1忽地笑LaTMT基因克隆及表达分析采用的引物序列

Table 1Primer sequences used for gene cloning and expression analysis ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

引物 Primer序列(5'→3') Sequence(5'→3')用途 ApplicationLaTMT3'-RACE-R1AGATGCATTAGACCAA3'-RACELaTMT3'-RACE-R2GGGAAAGTTTGTTAGCG3'-RACELaTMT5'-RACE-F1TGAATGCTGATCGGAT5'-RACELaTMT5'-RACE-F2TCATCGGGTCGTAGTGT5'-RACELaTMT-ORFFATGCGCACACTCCTCCACACGTG扩增开放阅读框(ORF)Amplificationofopenreadingframe(ORF)LaTMT-ORFRCTCTGGTTTACGGCATGTA扩增开放阅读框(ORF)Amplificationofopenreadingframe(ORF)LaTMT-pETRATCGGGATCCCGGTC-CAGTCGAACCG原核表达分析ProkaryoticexpressionanalysisLaTMT-pETFATCGAAGCTTCTCTGGTTTACG-GCAT原核表达分析ProkaryoticexpressionanalysisLaActinFATCCAGGCCGTCCTTTC扩增内参基因AmplificationofreferencegeneLaActinRTGGAAGAGAACCTCTGGGCA扩增内参基因AmplificationofreferencegeneLaTMT-RTRGGGGTTAGGAGACAAAGTAT检测LaTMT基因相对表达水平DetectionofrelativeexpressionofLaTMTgeneLaTMT-RTFTTTCATCGGGTCGTAGTG检测LaTMT基因相对表达水平DetectionofrelativeexpressionofLaTMTgene

1.2.3序列分析用BLASTp程序(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行氨基酸序列比对分析；利用DNAman对LaTMT蛋白及与其同源的其他植物的γ-TMT氨基酸序列进行多重比对，采用MEGA5.0软件中neighbor-joining(NJ)法进行系统进化树构建；利用ExPASy软件(http:∥web.expasy.org/protparam/)计算蛋白质理论等电点、理论相对分子质量、亲水性和疏水性等；用在线软件ChloroP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)查找序列N端信号肽；利用在线软件SOPMA(http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对LaTMT蛋白的二级结构进行预测；利用SWISS-MODEL软件(http:∥swissmodel.expasy.org/)对LaTMT蛋白的三级结构进行预测；通过PROSITE(http:∥prosite.expasy.org)数据库对LaTMT蛋白的功能结构进行预测。

1.2.4基因的原核表达及SDS-PAGE电泳检测对重组质粒pMD-LaTMT和空载体pET28a分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，用琼脂糖凝胶电泳检测并回收酶切产物；回收片段经T4DNA连接酶连接以获得重组质粒pET28a-LaTMT，然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；经PCR验证后，挑取阳性克隆子进行测序；将测序验证正确的重组质粒pET28a-LaTMT和空载体pET28a转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取阳性克隆子进行诱导表达。

将转入空载体pET28a和重组质粒pET28a-LaTMT的BL21菌株分别接种于4 mL LB液体培养基中培养，随后将菌液转接到50 mL LB液体培养基中，直至其OD600达到0.2，随后加入终浓度1 mmol·L-1异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达；选取IPTG诱导0、3、6、9和19 h的菌液1 mL，12 000g离心5 min，弃上清液并加入200 μL无菌水重悬菌体，同时加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，置于沸水浴中加热10 min，室温下离心20 min；取30 μL上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，并记录分析结果。

1.2.5组织表达特性分析在忽地笑花期称取根、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎约0.1 g，在盛叶期称取叶片约0.1 g，液氮速冻后迅速置于-70 ℃冰箱保存；参照植物RNA提取试剂说明书提取不同组织的总RNA，用Random Primer经反转录酶M-MLV将总RNA反转录成cDNA；以cDNA为模板，分别根据内参基因LaActin和LaTMT基因的特异引物(表1)进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系总体积15.0 μL，包含2.0 μL cDNA模板、7.5 μL 2×SYBR PremixExTaqⅡ、10.0 μmol·L-1上游和下游引物各0.1 μL、5.3 μL 重蒸水。 扩增程序为：95 ℃预变性2 min； 95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40个循环。每个样品均设置3次重复。反应结束后，利用2-ΔΔCt法分析其相对表达量。

2　结果和分析

2.1LaTMT基因的克隆和序列分析

通过PCR扩增，分别得到LaTMT基因片段的5′-端和3′-端序列(图1)；去除载体序列后，将测序验证正确的5′-端扩增片段(961 bp)和3′-端扩增片段(956 bp)与LaTMT基因已知序列进行拼接，得到1条长度为1 458 bp的全长cDNA序列；经ORF Finder软件预测该基因的ORF长度为1 017 bp(图2)。对该基因的全长序列进行BLASTx分析，发现其编码的蛋白具有典型的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基转移酶保守结构域，因此，将该基因命名为LaTMT。根据预测得到的ORF序列设计特异引物LaTMT-ORFF和LaTMT-ORFR，并以反转录得到的忽地笑cDNA为模板进行PCR扩增，得到约1 100 bp的ORF片段(图1)，与预测的结果一致。

M: DL2000 marker; 1,3: 5′-RACE; 2,4: 3′-RACE; 5: 开放阅读框Open reading frame.

图1忽地笑LaTMT基因的PCR扩增结果

Fig. 1PCR amplification result ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

*： 终止密码子 Stop condon.

图2忽地笑LaTMT基因全长核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

Fig. 2Full nucleotide sequence ofLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. and its amino acid sequence encoded

2.2LaTMT基因编码的氨基酸序列的生物信息学分析

对LaTMT基因编码的氨基酸序列的分析结果表明：LaTMT蛋白包含338个氨基酸残基(图2)，理论相对分子质量37 560，理论等电点pI 8.70；LaTMT蛋白在N端有44个氨基酸的导肽；在LaTMT蛋白序列中，从41～338位的298个氨基酸具有SAM-依赖性γ-生育酚甲基转移酶(SAM_GTMT)家族特征(图3)。此外，该蛋白还具有3个SAM结合位点，分别位于120～129、183～191和210～219位氨基酸处。二级结构预测结果显示：该蛋白中含有大量的α-螺旋和无规则卷曲以及少量的β-转角和延伸链；总体上，LaTMT蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。

以PDB数据库中的红藻(GaldieriasulphurariaP. De Luca, R. Taddei et L. Varano)肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶为模板(其与LaTMT蛋白的同源性为23.99%)，对LaTMT蛋白的三级结构进行建模，结果(图4)显示： LaTMT蛋白含有较多的α-螺旋，β-转角只占少数。

下划线表示SAM结合位点的氨基酸残基 The underlines indicate amino acid residues of SAM binding sites.

图3忽地笑LaTMT基因编码的氨基酸序列的功能位点分析

Fig. 3Functional site analysis on amino acid sequence encoded byLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

图4忽地笑LaTMT蛋白的三级结构

Fig. 4Tertiary structure ofLaTMTproteinfromLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

2.3LaTMT基因编码的氨基酸序列的同源性及进化分析

对忽地笑LaTMT基因编码的氨基酸序列与其他植物的γ-TMT蛋白的氨基酸序列进行比对。结果表明：LaTMT与油棕(ElaeisguineensisJacq.)的EgTMT、美洲油棕〔Elaeisoleifera(Kunth) Cortés〕的EoTMT、陆地棉(GossypiumhirsutumLinn.)的GhTMT、橡胶树〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕的HbTMT、可可(TheobromacacaoLinn.)的TcTMT、小麦(TriticumaestivumLinn.)的TaTMT和玉米(ZeamaysLinn.)的ZmTMT的一致性达64%～75%。多重比对结果(图5)显示：忽地笑LaTMT基因编码的氨基酸序列与上述植物γ-TMT蛋白的氨基酸序列具有较大的保守区域，同时连续相同的氨基酸残基数目较多，表明植物的γ-TMT蛋白具有较高的保守性。

1: 忽地笑Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.; 2: 油棕ElaeisguineensisJacq.; 3: 美洲油棕Elaeisoleifera(Kunth) Cortés; 4: 陆地棉GossypiumhirsutumLinn.; 5: 橡胶树Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.; 6: 可可TheobromacacaoLinn.; 7: 小麦TriticumaestivumLinn.; 8: 玉米ZeamaysLinn.

图5忽地笑LaTMT基因编码的氨基酸序列与其他植物γ-TMT的氨基酸序列的多重比对结果

Fig. 5Result of multiple alignment between amino acid sequence encoded byLaTMTgene fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. andγ-TMT amino acid sequence from other species

选取与LaTMT蛋白的氨基酸序列一致性大于60%的植物的γ-TMT序列，采用NJ法构建系统进化树，结果见图6。结果表明：不同植物的γ-TMT蛋白可分成单子叶植物源和双子叶植物源2大类，反映出γ-TMT蛋白的进化与其物种进化高度一致。此外，同一科属植物的γ-TMT蛋白聚在同一个分支上。例如：单子叶植物中，禾本科(Poaceae)的小麦、大麦(HordeumvulgareLinn.)、水稻(OryzasativaLinn.)和玉米的γ-TMT蛋白同属一个分支, 亲缘关系较近；忽地笑LaTMT蛋白与棕榈科(Arecaceae)的美洲油棕和油棕的γ-TMT蛋白亲缘关系较近，处于同一进化分支上，说明它们的进化地位可能一致。双子叶植物中，同为茄科(Solanaceae)的SolanumlycopersicumLinn.和马铃薯(SolanumtuberosumLinn.)的γ-TMT蛋白亲缘关系最近，聚在同一分支；菊科(Asteraceae)的CarthamusoxyacanthusBieb.、红花(CarthamustinctoriusLinn.)、向日葵(HelianthusannuusLinn.)和莴苣(LactucasativaLinn.)的γ-TMT蛋白聚在同一分支；豆科(Fabaceae)的大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)和百脉根(LotuscorniculatusLinn.)的γ-TMT蛋白的亲缘关系最近，形成同一分支；十字花科(Brassicaceae)的欧洲油菜(BrassicanapusLinn.)和拟南芥的γ-TMT蛋白属于同一分支，而锦葵科(Malvaceae)的陆地棉和可可的γ-TMT蛋白也聚在同一分支上。γ-TMT的系统发育关系与各物种的经典分类关系基本一致。

2.4LaTMT基因的原核表达分析

由于LaTMT蛋白的N端具有预测的叶绿体导肽，而对于大肠杆菌表达系统，导肽的存在可能影响重组酶的表达及功能。因此，本研究在原核表达的时候，设计了1对用以扩增LaTMT成熟蛋白编码区的引物LaTMT-pETR和LaTMT-pETF。在构建LaTMT基因原核表达载体后，将转入空载体pET28a和重组质粒pET28a-LaTMT的表达宿主菌进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，结果表明：经IPTG诱导后，含重组质粒pET28a-LaTMT的表达宿主菌出现1条相对分子质量约37 000的条带(图7)，与预测的LaTMT蛋白的理论相对分子质量一致，说明目标蛋白LaTMT成功表达。此外，随着IPTG诱导时间的延长，LaTMT蛋白的表达量有显著的增加。

1: 大麦HordeumvulgareLinn.; 2: 小麦TriticumaestivumLinn.; 3: 水稻OryzasativaLinn.; 4: 玉米ZeamaysLinn.; 5: 忽地笑Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.; 6: 油棕ElaeisguineensisJacq.; 7: 美洲油棕Elaeisoleifera(Kunth) Cortés; 8:SolanumlycopersicumLinn.; 9: 马铃薯SolanumtuberosumLinn.; 10:CarthamusoxyacanthusBieb.; 11: 红花CarthamustinctoriusLinn.; 12: 向日葵HelianthusannuusLinn.; 13: 莴苣LactucasativaLinn.; 14: 大豆Glycinemax(Linn.) Merr.; 15: 蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaGaertn.; 16: 百脉根LotuscorniculatusLinn.; 17: 拟南芥Arabidopsisthaliala(Linn.) Heynh.; 18: 欧洲油菜BrassicanapusLinn.; 19: 陆地棉GossypiumhirsutumLinn.; 20: 可可TheobromacacaoLinn. 分支上的数据代表自展值Datums above the branches indicate bootstrap values. Ⅰ： 单子叶植物 Monocotyledon； Ⅱ： 双子叶植物Dicotyledon.

图6忽地笑LaTMT蛋白与其他植物γ-TMT蛋白的NJ系统树

Fig. 6NJ phylogenetic tree of LaTMT protein fromLycorisaurea(L’Hér.) Herb. andγ-TMT protein from other species

2.5忽地笑不同组织中LaTMT基因的表达分析

以忽地笑LaActin基因为内参，采用实时荧光定量PCR方法分析LaTMT基因的组织表达模式，结果见图8。由图8可见：LaTMT基因在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中均有表达，且叶片中相对表达量最高，子房、雄蕊和鳞茎中相对表达量相对较低。表明LaTMT基因的表达具有一定的特异性。

M: Marker; 0,3,6,9,19: 分别经异丙基硫代半乳糖苷诱导表达0、3、6、9和19 hInduced expression by isopropyl thiogalactoside for 0, 3, 6, 9 and 19 h, respectively. 箭头示目标蛋白 The arrow indicates the target protein.

图7忽地笑pET28a-LaTMT在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图谱

Fig. 7SDS-PAGE electrophoresis pattern of pET28a-LaTMT ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb. expressed inEscherichiacoli

图8忽地笑不同组织中LaTMT基因的相对表达量

Fig. 8Relative expression ofLaTMTgene in different tissues ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb.

3　讨论和结论

采用RACE方法从忽地笑中克隆得到γ-TMT基因，并命名为LaTMT，该基因cDNA全长1 458 bp，开放阅读框为1 017 bp，编码1个具有338个氨基酸残基的多肽。LaTMT蛋白在N端有44个氨基酸的叶绿体导肽，负责引导未成熟的LaTMT进入叶绿体，因此，LaTMT蛋白可能主要在叶绿体中行使功能，这与“拟南芥、玉米和马铃薯等种类的γ-TMT主要定位在叶绿体基质中[12]”的结果相一致。LaTMT基因编码的氨基酸序列与其他植物的γ-TMT基因编码的氨基酸序列一致性均在64%以上，说明该基因在进化上具有高度保守性。LaTMT蛋白与其他物种γ-TMT蛋白具有相似的保守域，且在NJ系统树上与美洲油棕和油棕的γ-TMT同源蛋白亲缘关系较近，进一步说明该基因在进化过程具有很高的保守性。此外，LaTMT基因属于SAM-GTMT基因家族中的1个成员。

LaTMT基因在忽地笑的不同组织中均有不同程度的表达，其中在叶片中的相对表达量最高。Dellapenna[6]认为生育酚的合成主要在高等植物的叶绿体中进行，因此LaTMT基因在叶片中的高度表达可能与此有关；而LaTMT蛋白N端具有叶绿体导肽的推测结果也进一步确认了这一结论。VE在提高植物自身对非生物逆境胁迫的抗性(抗光氧化、抗寒、抗旱和抗盐碱等)和细胞信号转导等方面也有重要作用[13-16]，而通过γ-TMT基因的表达提高植物体中VE含量则可以缓解非生物胁迫对其造成的损伤[17-18]。忽地笑对土壤水分、温度、酸碱性、荫蔽等环境因子的有极强的耐受性，推测LaTMT基因可能在其非生物胁迫抗性中起作用。此外，对LaTMT基因所具有的功能还需要进一步的验证。

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(责任编辑： 张明霞)

Cloning and expression analysis onγ-tocopherol methyltransferase geneLaTMTfromLycorisaurea

CAI Lili1,2, XU Sheng1, MA Rui1, WANG Ren1,2, XIA Bing1,2,①

(1. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China; 2. The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(1): 1-8

Using RACE method,γ-tocopherol methyltransferase (γ-TMT) gene was cloned from leaf ofLycorisaurea(L’Hér.) Herb., which was namedLaTMT. The result of sequence analysis shows that full-length cDNA ofLaTMTgene is 1 458 bp, in which, length of open reading frame (ORF) is 1 017 bp, and 338 amino acid residues are encoded. Theoretical relative molecular mass of the protein encoded byLaTMTgene is 37 560, theoretical isoelectric point is pI 8.70, which is a hydrophilic protein without transmembrane structure but with signal peptide structure. And this protein hasS-adenosylmethionine (SAM) methyltransferase conserved domain and includes three SAM binding sites. Its tertiary structure includes 44.08% ofα-helix, 32.84% of random coil, 12.72% of extended strand and 10.36% ofβ-turn. The analysis results of sequence alignment and phylogenetic tree show that LaTMT protein belongs toS-adenosylmethionine-dependentγ-tocopherol methyltransferase family, and its identity withγ-TMT protein from other plants is 64%-75%. In NJ phylogenetic tree, LaTMT protein andγ-TMT protein from monocotyledon are clustered into the same large category, and this protein with EgTMT ofElaeisguineensisJacq. and EoTMT ofElaeisoleifera(Kunth) Cortés is clustered into the same category, their relationship is close. The analysis result of genetic expression shows thatLaTMTgene can express successfully inEscherichiacoli, and its expression increases with prolonging of inducing time of isopropyl thiogalactoside (IPTG). Also,LaTMTgene can express in root, leaf, bud, ovary, stamen, petal and bulb ofL.aurea, in which, relative expression is the highest in leaf, and that is relative low in ovary, stamen and bulb, with obvious tissue specificity. It is suggested thatLaTMTgene fromL.aureahas high conservation in evolutionary process, the gene is mainly located in chloroplast and is related to resistance of abiotic adversity stress.

Lycorisaurea(L’Hér.) Herb.;γ-tocopherol methyltransferase gene; gene cloning; sequence analysis; expression analysis

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.01.01

2015-10-28

国家自然科学基金资助项目(31301798; 31270339); 江苏省科技计划产学研联合创新资金——前瞻性联合研究项目(BY2014131); 江苏省植物迁地保护重点实验室开放基金项目(QD201302); 江苏省科技计划项目苏北科技发展计划——科技富民强县项目(SBN201310073)

蔡黎丽(1991—)，女，江苏常州人，硕士研究生，主要从事药用植物学方向的研究。

Q785; Q943.2; Q949.71+8.25

A

1674-7895(2016)01-0001-08