白蔹多糖的分离纯化及其对小鼠脾细胞增殖的影响

李 岩，赵 宏，王宇亮，初 维，张 宇

(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007)



白蔹多糖的分离纯化及其对小鼠脾细胞增殖的影响

李 岩，赵 宏，王宇亮，初 维，张 宇*

(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007)

[目的]分离纯化白蔹多糖，研究白蔹均一多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。[方法]采用水提醇沉法提取白蔹多糖，通过三氯乙酸法脱除蛋白，用中空纤维超滤膜和DEAE Cellulose DE-52对白蔹多糖进行分离纯化，高效凝胶过滤色谱法鉴定纯度并测定分子量，PMP柱前衍生化测定单糖组成，采用MTT法测定均一多糖对ConA和LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。[结果]PAJM-A均一多糖分子量为1.29×105u，由甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xly)组成，其物质的量比为1.36∶1.87∶2.02∶1.58∶1.04，均一多糖对ConA诱导的T淋巴细胞和LPS诱导的B淋巴细胞有较显著的增殖作用。[结论]PAJM-A是一种新的白蔹均一多糖，并与ConA、LPS 对T、B淋巴细胞的增殖有协同刺激作用。

白蔹；多糖；分离纯化；脾淋巴细胞

白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹AmpelopsisJaponica(Thunb.)Makino的干燥块根[1]，广泛分布于华东、华北、中南、辽宁、吉林、贵州、广西等地。其味苦、辛、微寒，归心、胃经，具有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌之功效。白蔹中的化学成分复杂，目前已从中分离获得多糖类[2]、黄酮类[3-5]、有机酸类[6]、三萜[7]、甾醇类等成分，临床用于治疗疮痈肿毒、烧烫伤、癌性发热、支气管扩张咯血、手足皲裂、骨折等[8-13]。笔者对白蔹多糖进行分离纯化，并选择小鼠脾淋巴细胞增殖试验考察其对免疫作用的影响，旨在为研发理想的用于免疫调节的中药组分奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1仪器UV757CRT紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；LG10-2.4A型高速离心机(北京京立离心机有限公司)；3 500 u透析袋(上海源叶生物科技有限公司)；FDU-1200型真空冷冻干燥机(日本东京理化株式会社)；FA2004电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；TDL-5000B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；Waters-600高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters-2424 蒸发光检测器(美国Waters公司)；BSZ-100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)；FTIR-8400S型红外光谱仪(日本岛津有限公司)；SW-CJ-2FD型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2试剂白蔹由安国市万联中药饮片有限公司提供，经佳木斯大学药学院天然药物化学教研室张宇教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属中药白蔹，鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸均为Pharmacia公司产品，质量分数均>99%；DEAE Cellulose 52(Whatman公司)；三氟乙酸(美国Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1白蔹多糖的提取与分离纯化。 取白蔹干燥块根1 kg，用90%乙醇回流提取3次，每次2 h，弃去提取液，药渣加8倍量的水，回流提取3次，每次2 h，合并提取液，过滤浓缩，加入乙醇醇沉，使乙醇终体积分数为80%，静置24 h，抽滤得沉淀后冷冻干燥得白蔹粗多糖。粗多糖用三氯乙酸法除蛋白后醇沉，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，得白蔹多糖PAJM。

称取PAJM溶液依次过中空纤维超滤膜(150、100、50、20、10和6 ku)，用DEAE-52(80 cm×3 cm)进一步分离，用0～1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，采用苯酚硫酸法测定吸光度(A490)，收集洗脱液，透析，减压浓缩，冷冻干燥，得到均一多糖PAJM-A，备用。

1.3.2纯度及分子量测定。 采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC-ELSD)分析：色谱柱为Ultrahydrogel TM(Linear)水溶性凝胶柱(7.8 mm×300.0 mm)，标准葡聚糖(T20、T40、T110、T500、T2000)配制成2 g/L的标准品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，以色谱峰的保留时间(Rt)为横坐标，lgMw为纵坐标绘制标准曲线。

样品多糖分子量的测定：配制PAJM-A 2 g/L的溶液，以三蒸水作为流动相，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃。检验其纯度，通过标准曲线的回归方程得到PAJM-A的分子量。

1.3.3PAJM-A单糖组成分析。

1.3.3.1混合单糖对照品溶液的制备。精密称取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、木糖8种单糖对照品各10 mg，用双蒸水配成1 mmol/L的混合单糖对照品储备液。

1.3.3.2PAJM-A的水解。取PAJM-A 5 mg，加2 mL 2 mol/L TFA，封管后于120 ℃水解160 min，冷却后，将水解样品溶液加甲醇洗涤反复旋干，加入700 μL蒸馏水，备用。

1.3.3.3单糖对照品及PAJM-A水解产物的衍生化标记。分别取单糖对照品混合溶液和PAJM-A水解产物各700 μL，加入0.5 mol/L重蒸PMP甲醇溶液350 μL、0.3 mol/L NaOH溶液350 μL涡旋混匀，于70 ℃反应1 h，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液350 μL进行中和，加1 mL乙酸异戊酯萃取2次，再加入氯仿2 mL涡旋混匀，弃去氯仿液，重复3次后将水相过0.45 μm微孔滤膜供HPLC进样分析。

1.3.3.4色谱条件。ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱：流动相磷酸盐缓冲溶液-乙腈(83∶17)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长245 nm，进样量10 μL[14]。

1.3.4红外光谱分析。取均一多糖PAJM-A 1 mg与干燥的KBr粉末100 mg混合压片，在红外光谱仪4000～400 cm-1扫描，记录红外光谱图[15]。

1.3.5ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖试验。脾淋巴细胞悬浮液的制备参照文献[16-17]，在96孔培养板中每孔依次加入浓度为1×108个/mL的小鼠脾细胞悬液100 μL，除最外圈的空白对照加100 μL PBS，放入CO2培养箱中37 ℃培养24 h，剩下的60孔再加入ConA和LPS 20 μL使其终浓度为5 μg/mL，每孔加入不同稀释度的多糖溶液(RPMI-1640培养液配制)80 μL，每个稀释度设6个复孔。放置在5% CO2培养箱中37 ℃培养48 h。每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，继续培养4 h，再加入二甲基亚砜100 μL，充分振荡，于酶标仪上492 nm处测定吸光度。

1.4数据分析用SPSS软件对试验数据进行分析，所得数据以均值±方差表示，组间用t检验进行比较。

2　结果与分析

2.1纯度及分子量经高效凝胶色谱鉴定纯度，色谱峰形基本上是单一而尖锐，说明多糖中相对分子质量分布较均一。标准葡聚糖标准曲线方程Y=-0.711 1X+11.706(R2=0.994 6)，分子量在20 000～200 000 u线性关系良好(图1)。PAJM-A出现对称的单一峰，可判断PAJM-A为均一多糖，PAJM-A保留时间(tR)为9.280 min，分子量(Mw)为1.29×105u(图2)。

图1　标准葡聚糖标准曲线Fig.1　Standard curve of standard glucan

图2　PAJM-A的高效液相凝胶渗透色谱图Fig.2　High performance liquid gel permeation chromatogram of PAJM-A

2.2PAJM-A单糖组成混合标准单糖对照品经PMP柱前衍生后，进行HPLC分析后得到8种标准单糖的色谱峰，混合单糖对照品及样品的HPLC色谱见图3。PAJM-A经衍生化后通过HPLC测定其单糖组成，结果表明，PAJM-A由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，物质的量比为1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04。

图3　对照品(A)和PAJM-A(B)衍生产物的HPLCFig.3　HPLC of reference substances (A)and PAJM-A(B)derived products

2.3IR分析PAJM-A的红外光谱图见图4。由图4可知，在3 500～3 300 cm-1有一个强且宽的O-H伸缩振动峰；次甲基-CH-的伸缩振动在3 000～2 800 cm-1出现一个小峰，是糖类的特征峰；1 400～1 200 cm-1的一组峰则是C-H的伸缩振动引起的，在1 735 cm-1左右无吸收，表明PAJM-A不含糖醛酸，在890 cm-1左右有吸收峰，可能为β-吡喃糖苷键。

图4　PAJM-A的红外光谱Fig.4　Infrared spectroscopy of PAJM-A

2.4PAJM-A对ConA和LPS诱导的小鼠脾细胞增殖的影响由表1可知，空白对照组与阳性对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)，ConA诱导脾细胞增殖，提示造模成功，药物组与空白对照组相比，各组吸光度均有极显著差异(P<0.01)，提示PAJM-A对ConA诱导T细胞增殖具有明显的促进作用，且在200～800 μg/mL与ConA诱导剂有协同作用，并具有明显的量效关系。

表1PAJM-A对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

Table 1Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte induced by ConA

组别Group浓度Concentrationμg/mLODODvalue空白对照组Blankcontrolgroup00.191±0.007阳性对照组Positivecontrolgroup00.258±0.015**PAJM-A8000.359±0.019**4000.305±0.008**2000.271±0.014**

注： 与空白对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，n=6。

Note： Compared with control group，* indicated significant differences (P<0.05)；** indicated extremely significant differences (P<0.01)，n=6.

由表2可知，阴性对照组与空白组相比，吸光度明显升高，且有极著性差异(P<0.01)，说明LPS能引起小鼠脾淋巴细胞体外增殖。药物组与空白对照组相比，各组吸光度均有极显著差异(P<0.01)，提示PAJM-A对LPS诱导B细胞增殖有明显的促进作用，且在200～800 μg/mL与LPS诱导剂有协同作用，并具有明显的量效关系。

3　结论与讨论

免疫学研究的一个重要方向在于将基础免疫学研究的成果应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等重要疾病发病机制的研究、特异性的预防和治疗措施的建立、新型疫苗的研制和开发等[18]。多糖为单糖组成的天然高分子化合物，20世纪60年代后多糖作为广谱免疫促进剂引起人们极大兴趣，赵武连[19]、张庆等[20]研究发现，多糖对淋巴细胞有一定的促进增殖作用。脾脏是最大外周免疫器官，是B淋巴细胞和T淋巴细胞的定居场所，T淋巴细胞和B淋巴细胞是免疫系统中非常重要的免疫细胞[21]，PAJM-A能有效促进脾淋巴细胞的增殖，并与ConA、LPS对T、B 淋巴细胞的增殖有协同刺激作用。

表2PAJM-A对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

Table 2Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte induced by LPS

组别Group浓度Concentrationμg/mLODODvalue空白对照组Blankcontrolgroup00.203±0.055阳性对照组Positivecontrolgroup00.249±0.080**PAJM-A8000.453±0.011**4000.327±0.012**2000.304±0.076**

注：与空白对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，n=6。

Note： Compared with control group，* indicated significant differences (P<0.05)；** indicated extremely significant differences (P<0.01)，n=6.

该研究首次对中药白蔹中免疫活性成分多糖进行分离纯化，为进一步分析白蔹多糖的一级结构和高级结构以及今后研究其构效关系奠定理论基础。高效凝胶渗透色谱法是目前测定多糖纯度和分子量的常用方法，具有快速、准确、分辨率高、重现性好、样品量小等优点[22]。白蔹多糖为水溶性多糖，在提取多糖时需要脱掉脂溶性成分，用无水乙醇和丙酮洗去杂质和一些色素，可以提高多糖的含量。在对粗多糖进行分离纯化时，DEAE-52的纯化效果较好，经HPGPC-ELSD检测后，PAJM-A呈单一对称峰，说明纯度可达98%以上，是均一多糖。该研究采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法[23]测定单糖组成，结果表明，PAJM-A的单糖组成均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖组成，其物质的量比为1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04。该研究结果表明，白蔹含大量的具有显著生物活性的多糖类成分，这进一步深化了对常用中药白蔹药效物质基础和功效的认识，为合理开发利用白蔹药材提供理论依据。

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Separation and Purification of Polysaccharides fromAmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino and Its Effects on Proliferation Function of Mice Spleen Lymphocyte

LI Yan, ZHAO Hong, WANG Yu-liang, ZHANG Yu*et al

(College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

[Objective] To separate and purify polysaccharides fromAmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino, and to study its effects on proliferation function of mice spleen lymphocyte transformation. [Method] Hot water extracting and TCA method were employed to isolate the PAJM. Hollow fiber ultrafiltration membrane and the DEAE Cellulose 52 were used to separate and purify polysaccharides, and the monosaccharide composition, and structure were preliminarily identified by IR and HPLC. Their effects on proliferation function of mice spleen lymphocyte transformation were determined by MTT. [Result] PAJM-A was 1.29×105u and it was mainly composed of Man, Rha, GlcA, Glc, Gal and Xyl in the molar ratio of 1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04. And the homogeneous polysaccharides were able to increase the proliferation of lymphocytes induced by ConA and LPS. [Conclusion] PAJM-A is a novel homogeneous polysaccharide, PAJM-A can effectively increase lymphocyte proliferation and enhance the effect of ConA, LPS-induced T and B cell growth.

AmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino; Polysaccharides; Separation and purification; Spleen cell

佳木斯大学校级创新团队(CXTD-2013-05)；佳木斯大学青年创新人才培养计划(22Zq201501)；佳木斯大学研究生科技创新项目(LZZ2015_030)。

李岩(1992- )，女，黑龙江宝清人，硕士研究生，研究方向：天然产物的研究与开发。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事天然药物有效成分的分离及结构研究。

2016-05-13

S 567

A

0517-6611(2016)17-137-04