散堆聚乙二醇开管毛细管液相色谱柱的原位制备与评价

张维冰,　彭　丽,　张凌怡,　高　羽,　陈雅静,　刘海燕

(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)



散堆聚乙二醇开管毛细管液相色谱柱的原位制备与评价

张维冰,彭丽,张凌怡,高羽,陈雅静,刘海燕

(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)

采用表面引发原子转移自由基聚合反应，原位制备了聚乙二醇开管毛细管液相色谱柱，色谱固定相床超长的聚乙二醇分子在毛细管内壁形成散堆结构,极大地提高相比及样品容量,扫描电镜可观察到毛细管内壁形成的床层表面粗糙。在毛细管液相色谱模式下,4-羟基苯甲酸、苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸和苯的混合样品被用于评价其分离性能,结果表明,所制备的新型开管柱不仅保留了开管柱分析速度快的特征,也因其散堆结构较通常的开管柱提供更多的作用位点,还能有效改善分离性能。连续5次进样,4种小分子的混合物保留时间的相对标准偏差均小于2.5%,说明该柱的重复性较好。进一步将色谱柱用于混合蛋白质的分离,也取得了良好的效果。

开管毛细管柱; 表面引发原子转移自由基聚合反应; 毛细管液相色谱

毛细管液相色谱具有柱效高,样品用量少,流动相和固定相消耗低,灵敏度高等优点,可方便与其他检测器在线联用[1-4],在食品[5-6]、蛋白质[7-8]、多肽[8-9]、医药[10-11]等领域得到广泛应用。毛细管开管柱具有通透性好,柱效高,反压小等特征,适于快速分析,但由于其柱容量和相比相对较低,极大地限制了其应用范围的拓展。

传统的开管毛细管柱中固定相床层的制备包括物理涂覆[12-13]和化学键合[14-15]2种方法,这些方法尽管可能产生足够的床层厚度,但仍难于保证足够的裸露固定相表面和活性位点数。现有多种方法被用于改善开管毛细管柱性能,David等[16]采用动态原子转移自由基聚合方法成功制备了聚甲基丙烯酸丁酯和聚苯乙烯开管柱,通过改变温度、通入聚合溶液的线速度和反应时间来改变固定相的键合量。Nesterenko等[17]采用光引发原子转移自由基聚合反应制备聚甲基丙烯酸开管柱,并将其成功应用于8种蛋白质的分离。Rogeberg等[18]通过热引发原子转移自由基聚合方法制备了聚苯乙烯开管柱,并与生物质谱联用,实现了牛奶中蛋白质的分离。采用光引发或热引发的原位自由基聚合反应制备的开管柱受毛细管内径影响很大,内径越细,聚合物越容易贴壁生长,所以很少被应用于制备内径大于30 μm的开管柱[19]。表面引发原子转移自由基聚合反应(SI-ATRP)是将引发剂预先固定在毛细管内壁,通过可控聚合反应在毛细管内壁原位生长聚合物。Qin等[20]采用此方法在石英毛细管内壁修饰成三维波浪状聚合物涂层,然后将Zr4+固定在聚合物侧链末端,再利用Zr4+与磷酸化肽段中磷酸基团的螯合作用选择性富集磷酸化肽段,柱负载量、富集效率、富集特异性等都比传统的磷酸锆开管柱高。潘一廷等[21]采用SI-ATRP制备了葡萄糖聚合物修饰的开管毛细管柱,并在毛细管电色谱模式下成功分离了小分子混合物和蛋白质大分子。

本文分别采用原子转移自由基聚合法(ATRP)和SI-ATRP聚合法制备poly(GMA-co-PEGDA)开管柱,并对其结构和色谱分离性能加以研究。

1　实验部分

1.1试剂

聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA,Mn=250)、甲基丙烯酸缩水甘油酯 (GMA,纯度97%),偶氮二异丁氰(AIBN),氯化亚铜(纯度99%),γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-maps),肌红蛋白(Myo),卵清蛋白(ova)购自Sigma-Aldrich(美国)公司;1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA,纯度98%)购自J&K Chemical Ltd.(美国);氯化亚铜(CuCl),氯化铜(CuCl2),2-溴异丁酰溴,3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),苯甲酸(BA),2,4-二羟基苯甲酸(2,4-DHB),对羟基苯甲酸(4-HB),牛血清白蛋白(BSA),细胞色素C(cyt-c)购自阿拉丁有限公司;苯,三乙胺,环己醇,甲酸,氢氧化钠,盐酸,磷酸二氢钠为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司;乙腈(ACN,色谱纯),甲醇(色谱纯)购自山东禹王实业有限公司;乙醇(色谱纯)为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;熔融石英毛细管(50 μm× 375 μm；200 μm× 375 μm),购自邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司(中国)。

1.2仪器设备

P1201S 高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司),紫外检测器(苏州汇通色谱分离纯化有限公司),Arium 611 超纯水仪(赛多利斯集团,德国),超声波清洗仪(Autoscience,天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。高压恒流泵的出口端与T型三通相连,三通的另外两接口分别与分流毛细管(200 μm× 375 μm×35 cm) 和毛细管开管柱相连,分流比控制在1/200左右。

1.3poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的制备

1.3.1石英毛细管的活化毛细管内壁活化的方法采用酸碱处理法。0.1 mol/L HCl溶液冲洗毛细管1 h,超纯水将柱内环境冲洗至中性,0.1 mol/L NaOH溶液冲洗毛细管0.5 h,超纯水和甲醇各冲洗0.5 h,最后N2吹干,密封保存,备用。

1.3.2ATRP反应制备poly(GMA-co-PEGDA)开管毛细管柱毛细管柱硅烷化:用注射器将φ=30%的γ-maps 丙酮溶液灌入毛细管内,用聚四氟乙烯管密封后,室温静置反应24 h,再依次用甲醇、超纯水、甲醇冲洗毛细管,除去管内残留物,最后N2吹干备用。

ATRP聚合反应:将PEGDA、GMA,AIBN溶于甲醇中,并超声5 min,得无气泡均相溶液。再将其充入经γ-maps处理过的毛细管中,两端封口后室温下静置1 h,用N2吹5 min,除去毛细管柱中间的聚合物溶液,管壁留下一层薄膜,密封,在65 ℃的水浴中反应22 h。待反应完全后,依次用甲醇、水冲洗10 min,最后水封保存。

1.3.3SI-ATRP反应制备poly(GMA-co-PEGDA)开管毛细管柱引发剂的合成:依次将1.875 mL APTES,1.4 mL 三乙胺,12.5 mL 四氢呋喃加入50 mL 三颈烧瓶中,通氮气除氧并冰浴30 min。将1.25 mL 2-溴异丁酰溴缓慢滴加到反应液中,于25 ℃下剧烈搅拌4 h,然后将反应液离心取上清液,最后将上清液旋干,得黄色黏稠状产物,2-溴-2甲基-N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)丙酰胺(BIBAPTES),充N2,密封后4 ℃保存备用。

引发剂的固定:将BIBAPTES溶于乙醇溶液中,配置成10 mg/mL 的乙醇溶液,用注射器推入活化后的石英毛细管中,密封,37 ℃水浴中反应16 h,最后用乙醇反复冲洗,氮气吹干,密封保存。

SI-ATRP聚合反应:将337.5 mg PEGDA,497.5 mg GMA,7.8 mg PMDETA,0.5 mg氯化铜溶于2.1 mL环己醇中,超声10 min后,加入3.0 mg氯化亚铜,超声10 min,迅速通入上述石英毛细管,密封,25 ℃水浴中反应36 h后,依次用甲醇、水冲洗10 min,最后水封保存。

2　结果与讨论

2.1poly(GMA-co-PEGDA)开管毛细管柱的制备与表征

2.1.1poly(GMA-co-PEGDA)开管毛细管柱的制备本文设计了2条制备路线。第1条路线是采用ATRP聚合法(图1(a)),此方法过程简单,操作方便,但是在制备较长的毛细管柱时,为防止柱堵塞,氮吹时间需加长,这样就导致柱内留下的聚合溶液较少,故此方法不适合制备较长的开管毛细管柱。

第2条路线(图1(b))是采用SI-ATRP聚合法。首先,用APTES改性2-溴异丁酰溴,合成BIBAPTES,通过硅烷化反应将BIBAPTES固定在毛细管内壁,采用表面原子转移自由基聚合法,在毛细管内表面嫁接聚合物,得到Poly-GMA-co-PEGDA开管柱。SI-ATRP是利用过渡金属配合物实现活性自由基和非活性自由基的转换,既避免了活性自由基的猝灭,也确保了活性自由基处于较低的浓度,这样可以避免常规自由基聚合反应中出现的堵塞毛细管现象,有效地增加了固定相的比表面积,提高了活性位点的覆盖度。故最后确定此路线作为本文实验的制柱方案。

2.1.2poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的扫描电镜表征为了确保开管柱的通透性,图1(a)路线中的氮吹时间必须足够长,必将导致固定相键合量较少,扫描电镜(图2(a))也证明了这一点。采用图1(b)的路线制备聚乙二醇开管柱时,聚合物最初以梳状结构向管中心生长,但随着链的增长,梳状结构坍塌,通过空间位阻和侧链的分子作用相互聚集,形成散堆结构。溶剂的作用类似于毛细管开管柱制备过程中的致孔剂,但是在这里影响不大。图2(b),2(c),2(d)示出了反应12,36,48 h后的扫描电镜图,结果表明毛细管内壁嫁接了表面高度粗糙的聚合物,固定相的键合量随着反应时间的延长而增加,较图2(a)比表面积有明显改善。

图1　Poly-GMA-co-PEGDA开管柱的制备路线Fig.1　Preparation procedure of poly-GMA-co-PEGDA open tubular columns

图2　Poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的扫描电镜图Fig.2　SEM images of poly(GMA-co-PEGDA) open tubular columns

2.2分离性能评价

2.2.1ACN体积分数对分离的影响Wang等[22]研究表明,流动相中有机相的比例是影响样品在固定相中保留行为的主要因素。本文考察了乙腈体积分数对poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的柱性能影响，实验条件为：流动相为pH 3.0的25 mmol/L的PBS的乙腈水溶液(φ(ACN)=30%；c(PBS)=25 mmol/L);流速:0.25 μL/min,分离柱:1 m×50 μm;紫外检测波长:214 nm。结果见图3，由图表明,乙腈体积分数对分离效果和洗脱能力有很大影响。当体积分数为40%时,洗脱能力较强,但是样品均未达到完全分离(其中，R1、R2、R3分别是4-HB与BA,BA与2,4-DHB,2,4-DHB与苯之间的分离度，其中，R1=0.846,R2=1.14,R3=0.807),而当质量分数为30%时,洗脱能力稍弱,但是分离度较好(R1=1.63,R2=1.91,R3=1.86),综合考虑,选取流动相中乙腈体积分数为30%。

图3　ACN体积分数对保留因子的影响及poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的分离色谱图Fig.3　Effects of ACN volume fraction on retention factor and separation on poly(GMA-co-PEGDA) open tubular column

图3(a)显示,随着乙腈体积分数的增加,几种样品的保留因子k均减小,证明了该柱的反相分离模式。另一方面,图3(b)几个样品的出峰顺序表明样品分子与固定相之间还存在氢键作用。图3(c)所示为采用ATRP聚合反应制备的poly(GMA-co-PEGDA)开管柱的分离色谱图,4种化合物均未达到基线分离,表明采用SI-ATRP聚合法制备的poly(GMA-co-PEGDA)开管柱具有更好的分离性能。

2.2.2pH对分离的影响不同的pH条件可以使离子型样品发生不同程度的解离,所以流动相的pH值直接决定了样品在分离中的存在形式。表1示出了4-HB,BA,2,4-DHB 和苯在4种pH条件下的分离度。当pH值增加时,4-HB,BA,2,4-DHB这3种样品的解离程度增加,氢键相互作用减弱,疏水相互作用对保留的贡献增强。实验结果表明pH为3.0时混合样品可以得到最佳分离。

表1　pH对分离度的影响Table 1　Effects of pH to resolution

2.2.3缓冲液浓度对分离的影响分别考察了20,25,30,40,50,60 mmol/L的缓冲液对柱分离的影响。实验条件为：流动相:含φ=30% ACN的PBS溶液，pH 3.0;流速:0.5 mL/min;分离柱:1 m×50 μm;紫外检测波长:214 nm。结果表明,当缓冲液浓度小于30 mmol/L时,样品的保留因子有微弱变化,主要是因为固定相表面含有富水层,当流动相中的盐进入固定相的水化层会增大固定相的容积,改变样品与固定相的作用面积,从而影响保留因子。但是当固定相容积达到最大时,再增加缓冲液浓度则不会构成明显变化,所以当缓冲液浓度大于30 mmol/L时,样品的保留因子变化较小。结果表明,当磷酸缓冲液浓度为25 mmol/L时,样品间分离度最大(R1=1.77,R2=1.94,R3=2.58)。

图4　磷酸缓冲液浓度的影响Fig.4　Effects of the concentration of PBS

2.3poly(GMA-co-PEGDA)开管毛细管柱在蛋白质分离中的应用

近年来,随着人们对蛋白质分子结构的深入研究,蛋白质组学的地位日益凸显,为了进一步推进其研究,需发展快速、高效、高灵敏度和高选择性的蛋白质分离技术。小分子混合样品的分离已经证明该柱的分离模式是反相作用模式,同时还存在较强的氢键作用,对蛋白质的分离具有较大的潜力。图5示出了用该柱分离4种蛋白质混合物(cyt-c,BSA,ova,Myo)谱图,实验条件为：分离柱:1 m×50 μm;流动相:ACN-H2O混合液(φ(ACN)=50%,含φ=0.1%甲酸);流速:0.4 μL/min,分离效果较好。

图5　蛋白质的分离Fig.5　Separation of proteins

2.4柱重复性的考察

在优化的分离条件下,考察了色谱柱的重复性。poly(PEGDA-co-GMA)柱连续进样5次,4-HB,BA,2,4-DHB与苯的保留时间的相对平均偏差(n=5)均小于3%,具有较好的重复性。

3　结　论

柱容量低和比表面积小一直是开管毛细管柱发展道路上的最大瓶颈,目前已有很多改善方法,如动态反应,原子转移聚合反应等,其中SI-ATRP因具有反应定向性和可控性,有望成为制备毛细管开管柱最佳选择。本文以GMA为功能单体,PEGDA为交联剂,通过SI-ATRP聚合法原位制备了聚乙二醇开管毛细管液相色谱柱，散堆的聚乙二醇固定相显著增加了开管柱的比表面积和作用位点数。用BA,4-HB,2,4-DHB和苯评价了该柱的分离性能,研究表明样品分子与固定相之间是反相作用模式,同时还存在较强的氢键作用力,这对于蛋白质的分离具有极大的优势。最后,考察了重复性,实验结果表明重复性较好。在今后的研究中,可以通过对该柱改性，或者增加柱长和减小毛细管内径来增加其柱效,进一步将其应用于蛋白组学中的分离分析。

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Situ Preparation and Performance Evaluation of Open Tubular Columns Fabricated by Bulk Polyethylene Glycol for Capillary Liquid Chromatography

ZHANG Wei-bing,PENG Li,ZHANG Ling-yi,GAO Yu,CHEN Ya-jing,LIU Hai-yan

(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

An open tubular capillary liquid chromatography column (OTCLC) coated by poly[glycidyl methacrylate-co-poly(ethylene glycol) diacrylate] (GMA-co-PEGDA) was prepared by surface initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP).The polyethylene glycol grafting resulted in the formation of bulk structure,obviously increasing the phase ratio and column capacity.Characterized by scanning electron microscopy (SEM),the monolithic layer was observed to be rough.Four small molecules including 4-hydroxy benzoic acid,benzoic acid,2,4-dihydroxy benzoic acid and benzene were used to evaluate the separation performance of the open-tubular capillary liquid chromatography column.The results showed that bulk structure of the poly(GMA-co-PEGDA) OTCC not only remained the characteristic of fast separation but also provided more active sites.The run-to-run (n=5) relative standard deviations (RSDs) for retention time for 5 consecutive injections of 4 molecules were less than 2.5%,indicating good repeatability.Finally,the OTCC was applied to the separation of protein mixtures,and also obtained good separation ability.

open tubular capillary column; surface initiated atom transfer radical polymerization; capillary liquid chromatography

A

1006-3080(2016)03-0357-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.03.010

2015-09-28

国家自然科学基金项目(21475044);国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ120044)

张维冰(1964-),男,安徽合肥人,教授,博士,研究方向为色谱理论及应用等。E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn

通信联系人：刘海燕,E-mail:hyliu@ecust.edu.cn

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