芪归健脑颗粒抑制老年痴呆大鼠海马组织iNOS表达及NO含量的影响

王银龙，单铁英



芪归健脑颗粒抑制老年痴呆大鼠海马组织iNOS表达及NO含量的影响

王银龙1，单铁英2

1.河北工程大学附属医院(河北邯郸 056002)，E-mail：hdwyl0812@163.com；2.河北工程大学

摘要：目的研究芪归健脑颗粒对老年性痴呆(AD)大鼠海马组织诱导型一氧化氮分酶(iNOS)表达及一氧化氮(NO)含量的影响。方法SD大鼠海马内注射Aβ25-35，制备AD大鼠模型，实验分为3组：假手术组、模型组和治疗组。治疗组在造模前后用芪归健脑颗粒灌胃。用Morris水迷宫测定各组大鼠的学习记忆能力；Western blot测定各组大鼠海马组织iNOS蛋白表达；硝酸还原酶法检测各组大鼠海马组织NO含量。结果模型组的逃避潜伏期延长，单位时间内跨越原平台次数减少，海马组织iNOS的表达水平及NO含量均升高，与假手术组比较均有统计学意义(P<0.05)；治疗组的逃避潜伏期缩短，单位时间内跨越原平台次数增多，iNOS表达水平及NO含量下降，与模型组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论芪归健脑颗粒对Aβ25-35所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显的改善作用，其机制可能是芪归健脑颗粒通过抑制iNOS的表达和NO的生成，减轻Aβ25-35的毒性作用。

关键词：阿尔茨海默病；芪归健脑颗粒；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮

老年性痴呆(AD)又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是发生于老年人的一种中枢神经系统进行性、退行性疾病，病人主要表现为记忆力、判断力以及抽象思维等功能的减退或丧失。目前其病因尚不明确，也无治疗此病的特效药。本研究采用大鼠双侧海马注射β-淀粉样蛋25-35 (β-amyloid protein 25-35，Aβ25-35)建立AD模型，探讨芪归健脑颗粒对老年性痴呆大鼠海马组织诱导型一氧化氮合酶(induction nitricoxide synthase，iNOS)表达及一氧化氮(nitricoxide，NO)含量的影响，为临床上老年性痴呆的防治提供理论依据，也为新药的开发奠定基础。

1材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠30只(由河北医科大学动物实验中心提供)，鼠龄(10～12)月龄，体重(368.3±12.8) g。

1.2药品、试剂与仪器芪归健脑颗粒由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎等组成，购自黑龙江中医药大学。Aβ25-35购自Sigma公司，用无菌生理氯化钠溶液将Aβ25-35稀释成10 g/L，37℃孵育72 h，使其变为聚集状态的Aβ25-35，4℃冰箱保存备用。iNOS兔抗鼠多克隆抗体购自Santa Cruz公司。一氧化氮试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。脑立体定向仪：江湾Ⅰ型C，上海川沙花木农机厂制造。

1.3动物分组及模型将大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和治疗组，每组10只。3组大鼠均用质量浓度为20 g/L乌拉坦3 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上。参照大鼠脑立体定位图谱[1]，以前囟为零点穿刺点，位于前囟后3.5 mm，中线右侧旁开2 mm，用牙科钻钻开颅骨，以微量注射器自脑表面垂直进针3 mm，模型组和治疗组均于双侧海马CA1区5 min内缓慢注射Aβ25-35各1 mL(10 mg)，留针5 min，假手术组则注射等量的生理氯化钠溶液，退针缝合伤口。术前3 d及术后18 d，治疗组灌胃芪归健脑颗粒40 mg/(kg·d)，模型组给予等量生理盐水，假手术组大鼠正常饲养。末次给药后次日用Morris水迷宫实验测定大鼠的学习记忆能力，次日宰杀大鼠，取脑海马组织检测iNOS的表达水平及NO的含量。

1.4大鼠空间学习记忆能力测试(Morris 水迷宫)各组大鼠在末次给药后次日进行Morris水迷宫测试大鼠学习和记忆能力。水迷宫的直径为120 cm、高55 cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水深42 cm，距池壁35 cm处放置一高40 cm，直径8 cm圆台。实验历时5 d，实验前1 d让大鼠自由游泳2 min，从第1天起，每天分上午、下午两段，每段训练3次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，并开始计时，若大鼠在120 s内找到站台的时间作为潜伏期；若大鼠在120 s内未找到站台则将其引至站台，潜伏期记为120 s。大鼠连续训练4 d后，在第5天进行定位航行实验，观察记录其上站台的潜伏期。

在定位航行实验完成后，大鼠休息3 h，撤去站台，以同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，观察记录120 s内其穿越原平台相应位置的次数，以此作为大鼠记忆能力的检测指标。

1.5Western blot检测iNOS蛋白分别取上述各组200 μg海马组织总蛋白提取物与5×SDS上样缓冲液混合均匀，100 ℃煮沸5 min，冰上冷却，上样于PAGE凝胶加样孔内，120 V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶底部。20 V恒压分别50 min和120 min将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，质量浓度为50 g/L的牛奶于37℃封闭1 h。将膜分别浸入兔抗鼠多克隆抗体iNOS(1∶300)溶液，4℃结合过夜。TTBS溶液洗膜，将膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(1∶10 000)，37℃反应1 h，TTBS溶液洗膜，化学发光法显色。

1.6硝酸还原酶法检测海马组织NO的含量将大鼠断头开颅取脑，在冰盘上分离出海马，先放入液氮中，随后放入-70℃冷冻保存。测量时，用冰生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入10 mL的小烧杯内。先取少量预冷的生理盐水放入小烧杯中，剪碎海马组织块，再加入冷生理盐水，总量是组织块重量的9倍，倒入匀浆管中，将小烧杯和匀浆管下端均放入冰水浴中，研磨制成10%的组织匀浆，在4℃条件下离心15 min (3 500 r/min)。取适量上清，采用硝酸还原酶法进行NO含量测定。蛋白定量用考马斯亮兰法。实验操作严格按照试剂盒说明进行。

1.7图像处理采用美国Kodak公司数码成像分析软件对Western blot显色区带的信号强度进行相对定量分析。

2结果

2.1芪归健脑颗粒对大鼠学习记忆行为的影响定位航行实验结果表明，随着训练天数的增加，各组寻找站台的潜伏期越来越短，表明3组大鼠通过学习，均可对水下的站台产生空间定位记忆。在训练1 d～4 d，模型组大鼠的平均潜伏期明显大于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，治疗组的潜伏期在训练2 d～ 4 d均显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

空间探索实验结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠穿越站台次数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。芪归健脑颗粒对AD大鼠的空间记忆能力有明显的改善作用。

表1　芪归健脑颗粒对大鼠学习记忆行为的影响(±s)

2.2芪归健脑颗粒对大鼠海马iNOS表达的影响 Western blot显示，假手术组海马组织iNOS表达量低，模型组海马组织表达量显著增高(P<0.05)；给予芪归健脑颗粒治疗后，大鼠脑海马组织iNOS表达量明显下降，接近假手术组(P>0.05)。详见图1、表2。

图1　Western blot检测芪归健脑颗粒抑制

组别niNOS假手术组100.049±0.006模型组 100.287±0.0251)治疗组 100.054±0.0072) 与假手术组相比,1)P<0.05;与模型组相比,2)P<0.05。

2.3芪归健脑颗粒对海马组织NO含量的影响与假手术组比较，模型组海马组织NO含量均显著升高，两组比较有统计学意义(P<0.05)。治疗组与模型组相比，海马组织NO含量明显降低，两组比较有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3　芪归健脑颗粒对海马组织NO含量的影响(±s)

3讨论

学习和记忆水平体现了脑的高级整合功能，其功能的减退或者丧失是脑衰老的一个重要标志。老年性痴呆的临床症状主要为智力减退、近记忆缺失，以及相关行为能力障碍，因此学习和记忆水平为评价老年性痴呆的诊断和疗效重要指标。Morris水迷宫是为检测脑的学习记忆功能而研制的，它操作简便，能较系统、全面地检测实验动物的空间认知能力。本实验水迷宫结果显示，模型组的定位航行潜伏期比假手术组明显延长，说明Aβ25-35具有神经毒性，造成大鼠学习记忆障碍，用芪归健脑颗粒对Aβ25-35所致AD模型大鼠治疗后，学习记忆障碍得到明显改善。

iNOS是催化产生内源性NO的酶类，NO是一种神经递质，与学习和记忆有着密切关系，在神经系统中具有重要的作用[2]。正常浓度的NO起着生理性的信息传递作用，而高浓度的NO主要表现为细胞毒性作用，导致神经细胞坏死。在AD大鼠脑内，大量的Aβ能激活的小胶质细胞从而促进iNOS的表达，持续产生大量NO，还可产生α干扰素以增加NO的产量。NO除作为自由基以及与超氧阴离子结合形成超氧亚硝酸盐(ONOO-)具有直接毒性外，还可通过激活COX-2，进一步激活炎症前阶段，产生花生四烯酸的级联放大反应而参与炎症反应[3]。体外实验证实，Aβ能诱导胶质细胞表达iNOS，产生大量NO导致神经元死亡[4]。在体研究进一步表明，脑内Aβ注射可导致局部胶质细胞增生伴iNOS大量表达[5]，特异性iNOS抑制剂可完全阻断在体条件下的NO合成[6]。

本实验结果表明，假手术组大鼠海马组织iNOS表达很少，AD模型组大鼠海马组织中iNOS表达水平比假手术组明显升高，而治疗组的大鼠海马组织中iNOS表达水平比模型组显著降低，提示AD模型组大鼠海马组织中升高的iNOS可以使神经细胞凋亡或坏死，发生学习记忆能力障碍或丧失；而经芪归健脑颗粒治疗后可显著降低AD模型大鼠海马iNOS表达水平，改善学习记忆障碍，起到防治老年性痴呆的作用。

参考文献：

[1]包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社，1991：30-34.

[2]邱幸凡，袁德培，王平，等.醒脑益智方对老年性痴呆模型大鼠大脑皮质及海马区nNOS表达的影响[J].河南中医，2006，26(4)：29-30.

[3]Smith DP，Ciccotosto GD，Tew DJ，et al.Concentration dependent Cu2+induced aggregation and dityrosine formation of the Alzheimer’s disease amyloid beta peptide [J].Biochemistry，2007，46(10)：2881-2891.

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[5]Weldon DT，Rogers SD，Ghilard JR，et al.Fibrillar beta-amyloid induces microglial phagocytosis，expression of inducible nitric oxide sythase，and loss of a select population of neurons in the rat CNS in vivo[J].J Neurosci，1998，18(6)：2161-2173.

[6]Ishii K，Muelhauser F，Leibl U，et al.Subacute NO generation induced by Alzheimer’s beta amyloid in the living brain：reversal by inhibition of inducible NO synthase [J].FASEB J，2000，14(11)：1485- 1489.

(本文编辑王雅洁)

中图分类号：R749.1R289.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.012

文章编号：1672-1349(2016)13-1478-03

(收稿日期：2015-09-07)

Qigui Jiannao Granule Inhibits the iNOS Expression of and NO Content of the Hippocampus in Rats with Alzheimer Disease

Wang Yinlong，Shan Tieying

The Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002， Hebei， China

Abstract：ObjectiveTo study the effects of Qigui Jiannao granule(QJG) on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the content of nitric oxide (NO) in the hippocampus in rats with Alzheimer disease.Methods The AD model rats were established by injecting Aβ25-35 into districts of hippocampuses.The experiment was included into 3 groups：sham operation group， model group and treatment group， the ability of learning and memory was detected by Morris water maze.The protein expression levels of iNOS in the hippocampus of each group rats were detected by western blot.NO content of hippocampal tissues was detected by nitrate reductase method.Results The latency of model group rats was lengthened， the frequency of passing through platform was decreased， the expression level of iNOS was increased；the differences were statistically significant compared with sham operation group (P<0.05).Qiguijiannao granule could obviously shorten the latency of AD rats and increase the frequency of passing through platform.It decreased the expression level of iNOS and content of NO， the differences were statistically significant compared with sham operation group (P<0.05).ConclusionsQiguijiannao granule has a protective effect on learning and memory of AD rats.Its mechanism may be that extract of astragalus can reduce Aβ25-35 toxic effect by inhibiting the expression level of of iNOS and content of NO.

Key words：Alzheimer disease；Qigui Jiannao granule；inducible nitric oxide synthase；nitric oxide

·基础医学论著/研究·