人转录激活因子5在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

乔云飞,杨　捷,姜正华,李允模

(扬州大学临床医学院 呼吸内科,江苏 扬州,225001)



人转录激活因子5在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

乔云飞,杨捷,姜正华,李允模

(扬州大学临床医学院 呼吸内科,江苏 扬州,225001)

摘要:目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中转录激活因子5(ATF5)基因的表达及临床意义。方法采用免疫组化方法检测ATF5在57例NSCLC患者肺癌组织以及癌旁正常肺组织中的表达，并按照性别、年龄、吸烟、病理分型、病理分期、淋巴结转移及分化程度将其分组，分析ATF5在不同组间表达的差别以及ATF5与癌胚抗原(CEA)的相关性。结果ATF5在NSCLC中的表达率显著高于癌旁正常肺组织(P<0.01); ATF5在NSCLC中的表达与性别、年龄、吸烟与否、病理分期、有无淋巴结转移均无相关性(P>0.05),而与肺癌的病理分型及分化程度有相关性(P<0.05):ATF5在腺癌中的表达显著高于鳞癌，在低分化组中的表达显著高于高-中分化组；ATF5表达与CEA异常有关(P<0.05)。结论ATF5在NSCLC中的高表达可能与肿瘤的发生、发展有关。

关键词:ATF5; 免疫组化; 非小细胞肺癌; 靶向治疗

人转录激活因子5(ATF5)是ATF/CREB家族的转录因子，含有282个氨基酸序列,基因位于染色体19q13.3[1],在细胞发育、分化、增殖和凋亡中扮演着多样化的角色[2-3]。近年来研究[4-7]发现，在神经胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、肾上腺皮质癌等恶性肿瘤中均有ATF5的高表达(仅在肝脏、睾丸的正常组织ATF5呈高表达，在他们的肿瘤组织中呈低表达)，且与肿瘤的分期、分化等有关。本研究通过免疫组化的方法检测ATF5在非小细胞肺癌(NSCLC)及正常肺组织中的表达，现报告如下。

1材料与方法

1.1一般资料

本研究标本来源于2009年1月—2013年12月在江苏省苏北人民医院胸外科手术的NSCLC病例57例，取其肺癌手术标本及癌旁正常肺组织做对照。所有病例系首次发病，手术前均未接受过任何形式的放射治疗、化学治疗或生物治疗等，术后均经病理检查确诊为肺癌，临床资料完整。根据2014年肺癌NCCN指南对病例进行TNM分期，并对患者的年龄、性别、吸烟与否、TNM分期、区域淋巴结转移、病理类型、分化程度等进行分析。

1.2试剂、仪器与设备

ATF5单克隆抗体(英国Abcam公司),DAB显色试剂盒及羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。石蜡切片机RM2145、烤片机(德国Leica公司)，电热恒温水槽DK-8A型(上海三发科学仪器有限公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，电子分析天平[奥豪斯国际贸易(上海)有限公司]，磁力加热搅拌器(上海南汇电讯器材厂)，抗原修复高压锅(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3方法

将包埋好的石蜡标本用切片机切为厚度约4 μm的蜡片，蜡片放入40 ℃左右的水浴槽温水中使之完全铺平，捞至防脱载玻片上。56 ℃烤片机内放置3 h。脱蜡及水化(100%二甲苯10 min→100%二甲苯10 min→100%乙醇5 min→100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min)，蒸馏水浸洗。适量3%H2O2滴于每张载玻片上，室温10 min后PBS洗3次，每次3 min。玻片放置于耐高温的玻片架上，高压锅中加热pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液至沸腾，将玻片架放入高压锅内，关闭至高压锅开始喷气，盖上压力阀约2 min,再将高压锅放入凉水中冷却至室温，取出玻片，放入湿盒，PBS冲洗3次，每次3 min。每张玻片上滴加适量ATF5抗体(浓度1:100)，抗体需完全覆盖组织，湿盒中保持4 ℃过夜。次日从冰箱中取出孵育的玻片后在室温下复温30 min，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加适量即用型二抗，室温孵育20 min,PBS冲洗3 min。滴加新配的DAB显色剂5 min，显微镜下控制染色深度，充分水洗。苏木素复染30 s，自来水冲洗，加入1%盐酸酒精分化2 s，再次冲洗后放入氨水中返蓝，再次冲洗。脱水及透明(70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→90%乙醇2 min→95%乙醇2 min→100%乙醇2 min→100%乙醇2 min→100%二甲苯5 min→100%二甲苯5 min)，最后封片。阴性对照组用PBS代替一抗，重复上述的步骤，结果为阴性。

以已知的直肠癌阳性标本为阳性对照标本。ATF5阳性表达免疫组化染色呈棕黄色或棕褐色。在显微镜下随机观察每个标本10个高倍视野，记录肿瘤细胞中染色阳性细胞的百分率，判断标准:阳性细胞百分率≤5%:0分; 6～25%:1分; 26～50%:2分; >50%:3分。显色程度:无显色:0分；浅黄色:1分；棕黄色:2分；棕褐色:3分。根据阳性细胞百分率和染色程度综合分析:0～1分为阴性(-); 2～3分为弱阳性(+); 4～5分为阳性(2+); ≥6分为强阳性(3+)。

1.4统计学方法

应用SPSS 17.0统计分析软件，实验数据采用χ2检验，检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ATF5在肺癌组织以及正常肺组织中的表达

ATF5在肺组织中的阳性表达主要定位于细胞浆，呈弥漫性或局灶性黄色或棕黄色颗粒样染色(图1-8)。ATF5在57例癌旁正常肺组织中有5例表达(8.8%)，均为弱阳性；在57例NSCLC中有42例表达(73.7%),其中弱阳性占40.5%,阳性占45.2%,强阳性占14.3%,与在正常肺组织中的表达比较有显著差异(χ2=49.56,P<0.01)。

2.2ATF5在NSCLC中的表达与相关临床及病理学指标的关系

为研究的表达与相关临床及病理学指标的关系，作者将57例NSCLC患者的资料按照性别、年龄、吸烟、病理分型、病理分期、淋巴结有无转移及分化程度将其分组，观察ATF5在不同组间的表达情况。研究结果表明，ATF5在NSCLC中的表达与性别、年龄、吸烟与否、病理分期、有无淋巴结转移均无相关性(P>0.05),而与肺癌的病理分型及分化程度有相关性(P<0.05)。见表1。ATF5在腺癌的表达(84.4%)显著高于鳞癌的表达(60%)；低分化组ATF5的表达(100%)也显著高于高+中分化组的表达(65.1%)。

图1 ATF5在正常肺组织中的阴性表达(IHC 200倍)

图2 ATF5在直肠癌组织中的阳性表达作为阳性对照(IHC 200倍)

图3 ATF5在肺腺癌组织中的阳性表达(IHC 200倍)

图4 ATF5在肺鳞癌组织中的阳性表达(IHC 200倍)

图5 ATF5在正常肺组织中的阴性表达(IHC 400倍)

图6 ATF5在直肠癌组织中的阳性表达作为阳性对照(IHC 400倍)

图7 ATF5在肺腺癌组织中的阳性表达 (IHC 400倍)

图8 ATF5在肺鳞癌组织中的阳性表达 (IHC 400倍)

表1　ATF5在NSCLC中的表达与临床病理指标的相关性

2.3ATF5在NSCLC中的表达与CEA的关系

本研究57例NSCLC病例中有18例癌胚抗原(CEA)异常(>5 ng/mL,参考值范围0～ 5 ng/mL),占31.6%，而在CEA异常病例中有17例ATF5有阳性表达(94.4%),显著高于CEA正常患者中ATF5的表达(64.1%)，ATF5表达与CEA异常有关(P<0.05)。

3讨论

肺癌已成为全世界最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关死亡原因中占第1位，每年大约有130万人死亡[8]。早期肺癌可通过手术治疗达到治愈，但绝大部分患者确诊肺癌时已是中晚期。肺癌中85%为NSCLC[9],其5年生存率在中国仅有15%[10]。全身治疗作为中晚期患者的主要治疗手段，在很长一段时间是以铂类联合另一种化疗药物(如依托泊苷、长春瑞滨或紫杉醇等)作为经典治疗方案，但全身化疗目前已经进入一个平台期[11],患者的生存率、生存时间等很难再有更大的提高。根据中国非小细胞肺癌靶向治疗10年高端峰会上提供的数据显示，在中国靶向治疗的10年来，NSCLC患者的OS显著提升了2.4倍，从14.1个月延长至33.5个月，5年生存率从8%增长到18%。

目前人类研究的比较成熟的是EGFR基因突变和ALK融合基因，相应的抑制剂已有药物上市用于临床。研究[12]显示在EGFR基因突变型患者中，吉非替尼作为一线治疗的治疗组较采用标准化疗的治疗组相比，其无进展生存期(PFS)和生活质量均有明显改善。2013年美国临床肿瘤学会(ASCO)推荐对于EGFR基因突变阳性的患者,EGFR TKI可作为一线治疗方案。同样，2014年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南也推荐可将ALK抑制剂埃克替尼作为ALK阳性的晚期NSCLC患者的一线治疗。肺癌是多基因参与的、多步骤形成的一个复杂的过程，现有的靶向治疗仅适用于存在基因突变的患者，如EGFR突变只在约20%的肺腺癌患者中，在非吸烟的亚裔女性人群中才有高达60%的突变率[13],对于EGFR野生型无突变的患者来说，TKI的治疗效果远没有标准化疗好。TKI在EGFR突变型患者治疗9～10个月后经常会出现获得性耐药的情况，导致病情的反复并恶化[14],ALK融合基因同样也存在着耐药的问题，这是目前靶向治疗的一个瓶颈。另外，针对KRAS突变这一高比例人群，尚无有效的针对性抑制剂治疗。

ATF5已被证实在多种恶性肿瘤中高表达，其在肿瘤中的作用机制也较为复杂，涉及多条信号通路，包括eIF2α～P/ATF4/CHOP通路、Wnt通路、RAS/MARK通路、PI3K通路等[15-19]。本研究中ATF5在肺癌组织中呈高表达，提示ATF5可能成为一个新的肺癌标志物。ATF5的表达与性别、年龄、吸烟与否、病理分期、有无淋巴结转移均无关，而与肺癌的病理分型及分化程度有关。ATF5在低分化组的表达高于高、中分化组，提示ATF5可能与肺癌的恶性程度、疾病进展、预后有关。ATF5在腺癌中的表达高于鳞癌，本身靶向突变基因就被证实在腺癌中较鳞癌更为普遍，ATF5有可能成为一个新的干预靶点来达到治疗肿瘤的目的，特别是在肺腺癌中。另外,ATF5与CEA有关，也提示ATF5在评估肺癌预后方面有一定的价值。最近的研究[20]还发现，治疗前CEA升高的EGFR阳性的腺癌患者有着更长的无进展生存期，对TKI的疗效评估有一定的预测作用，从侧面也反映了ATF5在靶向治疗中的可能价值。

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收稿日期:2016-04-13

中图分类号:R 734.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)15-009-05

DOI:10.7619/jcmp.201615003

Expression and clinical significance of activating transcription factor 5 in non-small cell lung cancer

QIAO Yunfei,YANG Jie,JIANG Zhenghua,LI Yunmu

(Department of Respiratory Medicine,Clinical Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of activating transcription factor 5(ATF5) in non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsATF5 expression in 57 NSCLC tissues and normal lung tissues near tumors were detected with immunohistochemical method.These patients were divided into groups according to sex,age,smoking,pathological type,pathological stage,lymphatic metastasis and differentiated degree.ATF5 expression was observed in different groups,and the correlation between its expression and carcino-embryonic antigen (CEA) was analyzed.ResultsATF5 expression was significantly higher in NSCLC tissues than in normal lung tissues near tumors (P<0.01).ATF5 expression in NSCLC had no correlation with sex,age,smoking,pathological stage and lymphatic metastasis (P>0.05),but was correlated with pathological type and differentiated degree (P<0.05).ATF5 expression in adenocarcinoma was significantly higher than that in squamous carcinoma.ATF5 expression in the poor differentiated group was significantly higher than that in the moderate or high differentiated group.ATF5 expression was also correlated with abnormality of CEA (P<0.05).ConclusionThe high expression of ATF5 in NSCLC may be associated with the occurrence and development of tumors.

KEYWORDS:activating transcription factor 5; immunohistochemistry; non-small cell lung cancer; targeted therapy