人BRIT1基因在宫颈癌组织中的表达及其临床意义分析*

麦　力，王　玎，胡　琴，聂　红，赵　清，陈维贤，邓淋曼

(重庆医科大学附属第二医院检验科　400010)



人BRIT1基因在宫颈癌组织中的表达及其临床意义分析*

麦力，王玎，胡琴，聂红，赵清，陈维贤，邓淋曼△

(重庆医科大学附属第二医院检验科400010)

摘要:目的检测宫颈癌组织和配对的宫颈非癌组织中的BRIT1表达情况，比较两者之间的表达差异。方法分别应用实时荧光PCR(RT-PCR)、免疫组化技术检测宫颈癌组织及其配对的宫颈非癌组织中BRIT1 mRNA和蛋白的表达水平，分析BRIT1蛋白表达水平与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤类型、肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。结果RT-PCR结果揭示宫颈癌组织中BRIT1 mRNA的表达水平低于配对的宫颈非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组化技术结果揭示63例标本中的44例(69.8%)宫颈癌组织BRIT1蛋白表达水平低于配对的宫颈非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)；在高级的病理分级和临床分期中，BRIT1蛋白的表达减少更为明显。结论BRIT1在宫颈癌癌组织和非癌组织中的表达差异提示BRIT1可能在宫颈癌的发生、发展中具有一定的作用。

关键词:BRIT1；宫颈癌；免疫组化；实时荧光定量PCR

宫颈癌是癌细胞起源于子宫颈的恶性肿瘤，又称子宫颈癌。宫颈癌是全球第三位高发的女性恶性肿瘤，是引起全球女性死亡的第四大“肿瘤杀手”[1]。据世界卫生组织统计，仅2010年全球新发宫颈癌病例52.9万，死亡病例27.5万，病死率高达52%，其中88%的死亡病例发生在发展中国家[1]。宫颈癌是导致女性死亡的一个主要疾病。因此，进一步研究宫颈癌发生、发展的分子机制，研究开发新的宫颈癌诊断和治疗方法，具有重要的理论和现实意义。BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)又称MCPH1(microcephalin)，是以大脑体积减小及智力迟钝为特征的原发性小头畸形的主要致病基因之一，因此该基因也称作小脑症基因[2]。目前研究证实BRIT1基因是DNA损伤应答通路中一个重要分子[3]。DNA损伤应答是机体早期抵御肿瘤发生的重要防线，因此推测BRIT1在肿瘤的发生、发展中扮演着重要作用。然而目前，BRIT1在宫颈癌组织中的表达和其潜在功能尚未得到证实。因此研究BRIT1在宫颈癌组织中的表达及临床意义，对认识宫颈癌的发生和发展机制有着重要的理论意义，同时可能为宫颈癌的诊断和靶向治疗提供重要的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料63对宫颈标本包括宫颈癌组织和同一病例的宫颈非癌组织，采集于重庆医科大学附属医院。所有标本的病理资料包括患者年龄、肿瘤分型、肿瘤大小、肿瘤的病理分级和临床分期等。每份组织标本分成2份：一份由4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片用于免疫组织化学分析；另一份液氮冻存，用于提取总RNA，用于实时荧光PCR(RT-PCR)分析。

1.2试剂RNA提取试剂盒Trizol购自美国Invitrogen公司，cDNA逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司，BRIT1一抗购自Abcam公司；HRP标记的IgG二抗购自北京鼎国生物技术公司；免疫组化试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.3方法

1.3.1PCR检测宫颈癌组织中BRIT1 mRNA的表达提取宫颈组织中的RNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，将cDNA稀释10倍后进行RT-PCR反应。反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 3.8 μL。引物序列如下：BRIT1引物正义链 5′- AGT GGG AGA GGC AAA AAG CC-3′，反义链 5′-GTT CGA ACG GCT CCT CAG AA-3′；GAPDH引物正义链 5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TT-3′，反义链 5′-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3′。反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，相同试验重复3次。

1.3.2免疫组化宫颈癌组织中BRIT1蛋白水平的表达宫颈癌组织石蜡包埋、切片，制作免疫组化组织片。免疫组化过程为：脱蜡，切片经二甲苯洗3次，每次5 min，再水化；抗原修复，柠檬酸抗原修复液(pH6.0)100 ℃，20 min；5%的山羊血清封闭；BRIT1一抗4 ℃孵育过夜；HRP 标记的IgG二抗25 ℃孵育30 min；链霉亲和素-过氧化物酶孵育30 min；DAB显色；显微镜观察，结果判读。由2位病理医生在不知晓临床病理参数的条件下，对免疫组化的结果进行量化打分。量化分值根据染色阳性细胞比率和染色强度进行综合量化。其中染色强度的打分标准如下：阴性(-，0分)，弱阳性(+，1分)，中等阳性(++，2分)，强阳性(+++，3分)。染色阳性细胞比率的打分标准如下：阳性细胞比率≤10%(0分)，10%<阳性细胞比率≤30% (1分)，30%<阳性细胞比率≤50%(2分)，50%<阳性细胞比率≤70%(3分)，70%<阳性细胞比率≤100%(4分)。总分值(0～7分)= 染色强度的分值+染色阳性细胞比率的分值。

2结果

2.1宫颈癌标本BRIT1 mRNA的表达采用RT-PCR检测31对宫颈组织中BRIT1 mRNA的表达情况，在31例标本中有19例(61.3%)宫颈癌组织标本的BRIT1 mRNA的表达水平低于其配对的宫颈非癌组织的表达，统计分析证实宫颈癌组织中BRIT1 mRNA的表达量比宫颈非癌组织中的表达量低(P=0.000 2)，见图1。

图1　　宫颈标本BRIT1 mRNA表达水平的比较

图2　　宫颈标本BRIT1蛋白表达水平的比较(400×)

图3　　宫颈组织中BRIT1蛋白的表达水平

2.2免疫组化检测宫颈癌标本BRIT1蛋白的表达采用免疫组化技术检测63对宫颈癌标本中BRIT1蛋白的表达水平，各组织标本的BRIT1蛋白的表达量化评分和经统计分析后，结果显示：63例标本中的44例(69.8%)宫颈癌组织BRIT1蛋白的表达水平低于配对的宫颈非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2；宫颈鳞癌组织和宫颈腺癌组织中BRIT1蛋白的表达均低于各自配对的宫颈非癌组织中BRIT1蛋白的表达，见图3。宫颈癌中BRIT1的表达量与肿瘤分级、肿瘤分期有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分型等没有相关性，见表1。

表1　　BRIT1蛋白表达水平与临床病理资料的相关性分析*

注：*BRIT1蛋白表达水平为免疫组化法检测量化打分结果，≤3分为低表达，>3分为高表达；aP<0.05，与肿瘤分级3级比较；bP<0.05，与肿瘤分期Ⅲ期比较。

3讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，是威胁女性健康最常见的“肿瘤杀手”。因此，进一步研究宫颈癌发生发展的分子机制将有助于宫颈癌诊断和治疗。而BRIT1在宫颈癌组织的表达和功能目前尚未证实。

BRIT1基因是一个新的关键的DNA损伤应答基因，可调控ATM/ATR信号通路，修饰染色体结构，直接参与DNA修复等过程。DNA损伤应答信号的正常激活是早期阻止肿瘤发生的重要机制，是抵御细胞内外损伤因子损伤基因组DNA的重要防线[4]。而BRIT1正是DNA损伤应答信号通路中的关键一环，且处于DNA损伤应答的早期阶段。多个研究小组已证实：在乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、前列腺癌[7]及慢性粒细胞白血病[8]等肿瘤组织中，BRIT1表达减少。此外，在BRIT1基因敲除的小鼠中，其基因组的不稳定性增加，肿瘤的易感性增加[9]。这些研究提示BRIT1可能是一个新的肿瘤抑制基因。因此，研究BRIT1在宫颈癌组织的表达及其功能有助于宫颈癌对肿瘤发生、发展的分子机制的认识；有利于提高宫颈癌的早期诊断和治疗。

本研究采用RT-PCR和免疫组化技术从mRNA和蛋白水平两个方面证实了BRIT1在宫颈癌组织中的表达低于宫颈非癌组织中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示：在31例标本中有19例(61.3%)宫颈癌组织中BRIT1 mRNA的表达低于配对的宫颈非癌组织的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果根据染色强度和阳性细胞比率进行量化评分后统计分析，结果显示：63例标本中的44例(69.8%)宫颈癌组织BRIT1蛋白表达水平低于配对的宫颈非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。在mRNA水平和蛋白水平，宫颈癌组织较配对的宫颈非癌组织BRIT1的低表达率基本一致，均在60%以上。这一结果提示BRIT1在宫颈癌组织的低表达可能与BRIT1基因在转录水平和转录后水平的表达调控失衡有关，如启动子区域的DNA甲基化、miRNA的调控失衡等。统计分析揭示，宫颈癌中BRIT1的表达量与肿瘤的病理分级和临床分期有一定的相关性，与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分型等没有相关性。这一结果提示BTIT1可能是宫颈癌细胞恶性程度的一个重要标志。此外，有多个报道显示BRIT1在其他肿瘤组织中也呈低表达，如Richardson等[5]研究表明在319例乳腺癌标本中，有93例乳腺癌标本中BRIT1的表达低于其配对的正常乳腺的表达，其低表达率为29%，且BRIT1的表达量与肿瘤分级呈负相关；而也有研究证实BRIT1的表达与乳腺癌的转移[10]和无复发生存时间呈负相关[11]。另有报道BRIT1在30例卵巢癌标本中有19例的癌组织较配对正常组织呈低表达[12]。在人体中，BRIT1基因定位于染色体8p23.1，在肿瘤细胞中这一区带易于杂合性缺失，这个可能是BRIT1在多个肿瘤组织中的表达缺失的重要原因。此外，BRIT1的表达缺失也可能与其转录水平和转录后水平的表达调控失衡有关，需进一步研究。这些研究结果进一步证实了BRIT1可能是一个新的抑癌基因，参与抑制肿瘤的发生、发展。BRIT1在宫颈癌组织和宫颈非癌组织中的差异表达，提示BRIT1可能在宫颈癌发生、发展具有重要的作用，为进一步研究其作用奠定了基础。

参考文献

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* 基金项目：重庆市卫生和计划生育委员会项目(2013-2-046)。

作者简介：麦力，男，主管检验技师，主要从事肿瘤分子生物学研究。 △通讯作者，E-mail:denglinmancqmu@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.002

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)14-1904-03

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-21)

Analysis of human BRIT1 expression and its clinical significance in cervical cancer*

MAILi,WANGDing,HUQin,NIEHong,ZHAOQing,CHENWeixian,DENGLinman△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the expression of BRIT1 in cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues,and to analyze the differences between the two tissues.MethodsThe expression of BRIT1 mRNA and protein in cervical cancer tissues and the paired cervical noncancer tissues was evaluated by RT-PCR and immmunohistochemistry.Its correlation with the clinicopathological parameters including age,tumor types,size,tumor pathological grade and clinical stage was analyzed.ResultsRT-PCR results showed that the BRIT1 mRNA level in cervical cancer tissues was significantly lower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05).The immmunohistochemistry results showed that the BRIT1 protein expression level in 44 cases of 63 (69.8%) samples wa slower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05);In high pathological grades and high clinical stages,the decrease of BRIT1 protein expression was more significant.ConclusionThe difference of the BRIT1 expression between the cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues suggests that BRIT1 may play a certain role in the occurrence and development of cervical cancer.

Key words:BRIT1；cervical cancer；immmunohistochemistry；real time-PCR