富血小板血浆对光老化皮肤成纤维细胞增殖的影响

贾传龙，陈 亮，杨清建，毕 波，卢勇周，郭 妤，朱晶晶，朱宁文，刘天一



实验研究

富血小板血浆对光老化皮肤成纤维细胞增殖的影响

贾传龙，陈 亮，杨清建，毕 波，卢勇周，郭 妤，朱晶晶，朱宁文，刘天一

目的 探讨梯度浓度的富血小板血浆对光老化皮肤成纤维细胞增殖能力的影响。方法 采用二次离心法制备富血小板血浆，利用紫外线照射的方法体外构建鼠的真皮成纤维细胞光老化模型，倒置相差显微镜观察在不同浓度富血小板血浆作用下，正常成纤维细胞以及光老化成纤维细胞的增殖情况。利用cck-8法测定不同浓度富血小板血浆培养条件下，正常成纤维细胞的生长曲线；利用细胞计数法计数不同时间段各组细胞数目。结果 正常成纤维细胞在1%、5%及10%浓度富血小板血浆作用下，细胞增殖量明显多于阴性对照组。而对于光老化成纤维细胞，在加入低浓度的富血小板血浆(1%)后细胞数量增加，凋亡细胞数量减少；在加入高浓度的富血小板血浆(5%及10%)后，光老化成纤维细胞数量明显减少，凋亡细胞数量增加。结论 在一定浓度范围内富血小板血浆对正常的成纤维细胞具有促进细胞增殖的作用，并且这种作用具有浓度依赖性。但对于光老化成纤维细胞，低浓度的富血小板血浆表现为减少光老化所致的细胞凋亡，而高浓度的富血小板血浆会加速光老化对成纤维细胞所造成的损伤。

富血小板血浆； 真皮； 成纤维细胞； 光老化； 细胞增殖

皮肤的老化包括内源性老化和外源性老化两种衰老进程[1]，其中内源性老化主要受到内在基因的调控，而外源性老化主要因受到紫外线的照射引起。真皮的成纤维细胞是内嵌于真皮乳头层和网状层的主体细胞，可以分泌大量的细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白等。紫外线特别是中波紫外线，可以穿透表皮损伤真皮的成纤维细胞，使成纤维细胞增殖发生受到影响，甚至凋亡[2-3]。

富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)是全血经分离后得到的血小板浓缩物，血小板中含有大量的生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等[4]。这些具有生物学比例的生长因子能够促进成纤维细胞的增殖，但在真皮成纤维细胞光老化的进程中，PRP是否能够促进光老化成纤维细胞的增殖，以及这种增殖是否具有浓度依赖性鲜有报道。自2015年5月起，复旦大学附属华东医院研究不同梯度浓度的PRP对光老化皮肤成纤维细胞增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠皮肤成纤维细胞的获取 取1～3 d SPF级C57 BL/6小鼠1只，乙醚麻醉将其处死后，浸泡于75%乙醇中约10 min，用DMEM洗去残留乙醇，置于培养皿中，分离背部皮肤，剪下皮肤组织块约1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37℃恒温消化4 h；将皮肤取出，镊子分离表皮和真皮，将真皮剪碎后，置于0.1%胶原酶中，37℃恒温摇床消化2 h，至组织块基本消失。1500 r/min离心5 min，收集沉淀，弃上清液，细胞以DMEM+10%FBS制成细胞悬液，吹打均匀后以约2×105/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养；接近80%融合时进行传代，比例约为1∶4。

1.2 PRP的制备及激活 用预先装有2.0 ml枸橼酸钠的50 ml针筒及18 G针头，以心脏取血的方式抽取新西兰大白兔动脉血20 ml，注入2支塑料离心管中，每管10 ml。以Aghaloo法进行离心。离心分为2次，第1次以215 r/min离心10 min,吸取全部上清液至交界面下约3 mm，移至另一离心管，平衡后再次离心;第2次以863 r/min离心10 min，离心管中液体分为2层，上层上清液为贫血小板血浆(platelet poor plasma)，下层为血小板浓缩物(platelet concentrate, PC)。吸取约3/4上清液弃掉，剩余约1 ml摇匀，即为PRP。PRP制备后从中抽取10 μl，立即用全自动血细胞分析仪行血常规分析，并检测血小板浓度，血小板计数均4倍高于全血则制备成功。在1 ml的PRP中加入100 μl的凝血酶激活剂，静止30 min后以12 000 r/min 4℃的条件高速离心5 min，获得的上清液经0.22 μm滤器过滤后，存于-80℃保存备用。1.3 成纤维细胞光老化模型的建立 本实验成纤维细胞光老化模型的建立是借助于课题组之前通过UVB反复照射所建立的体外光老化细胞模型[5]。

1.4 实验分组及不同浓度PRP的处理 将细胞按照每孔1×105的细胞密度接种于6孔板。实验分为4组：正常细胞组、正常细胞+梯度浓度PRP组、光老化细胞组、光老化细胞+梯度浓度PRP组。正常细胞+梯度浓度PRP组分别以1%、5%、10%PRP浓度培养细胞；光老化组细胞按照细胞光老化模型的建立方法处理；光老化+梯度浓度PRP组在细胞光老化的进程中，分别以1%、5%、10%PRP浓度培养处理细胞，正常鼠成纤维细胞作为对照组。以上各组在处理48 h后，倒置相差显微镜下观察各组细胞增殖变化，观察光老化组细胞与1%PRP组细胞形态变化。

1.5 cck-8法测定不同浓度PRP对正常成纤维细胞增殖的影响 取P1代鼠成纤维细胞，以2000个/孔的密度接种于96孔板，将细胞分为不加PRP组、1%PRP组、5%PRP组、10%PRP组。每组4个复孔，分别加入体积分数为1%、5%、10%PRP进行培养。在培养至24 h和48 h时分别向每组孔加10 μl CCK-8溶液，将培养板在体积分数5% CO2恒温孵箱内孵育2 h，用酶标仪测定于450 nm波长处吸光度，绘制48 h内细胞生长曲线。

1.6 细胞计数板计数24 h与48 h各组细胞数 在培养24 h与48 h时，向各组每个六孔板中加入0.2%胰酶0.5 ml进行消化约1 min；倒置相差显微镜下观察：细胞被消化完全时加入含血清的培养液终止消化。加样枪吸取20 μl消化的细胞混悬液冲入细胞计数板，对各组细胞进行细胞计数。

2 结果

2.1 不同浓度PRP对正常成纤维细胞增殖的影响 细胞贴壁培养48 h后，倒置相差显微镜下观察发现，与对照组相比，正常细胞加入含有1%、5%、10%PRP后，细胞密度明显增加。随着PRP浓度的增高，细胞的增殖也相应增加，细胞连接成片，伸展成长梭形样结构，生长旺盛，10%PRP组细胞由于增殖旺盛，甚至出现细胞接触抑制现象。见图1。

2.2 不同浓度PRP对光老化成纤维细胞增殖的影响 光老化细胞组细胞呈现肥大、铺展，失去其正常长梭形的细胞结构，在加入了梯度浓度的PRP后，光老化的细胞呈现出两种状态，1%PRP细胞组与光老化组细胞相比，细胞数量增多，密度增加，凋亡减少。而在5%和10%细胞组与光老化细胞组相比发现，后两者的细胞数量减少，细胞密度降低，细胞凋亡增加。见图2。

2.3 不同浓度PRP对光老化成纤维细胞增殖及形态的影响 成纤维细胞在光老化进程中，由于受紫外线直接与间接的损伤，细胞发生老化。图3中可以观察到光老化的成纤维细胞失去其长梭形的细胞结构，表现为细胞肥大及铺展的外观。在实验组中发现，加入1%PRP后，细胞数量较对照组细胞数量明显增加，细胞仍保持其长梭形的结构，较少出现衰老细胞肥大、铺展的外观。而在实验过程中逐渐增加PRP的浓度，PRP改善细胞衰老表现的能力逐渐降低，细胞数量也逐渐减少,表现为1%、2%PRP时，细胞数量高于UVB组。3%PRP组与对照组相比，变化不大，4%PRP组的细胞形态与对照组相比，无明显改善，且细胞数量也少于对照组。

2.4 不同浓度PRP对正常成纤维细胞的增殖作用 对于正常的成纤维细胞，从图4可以看出，在48 h的时间段内，不同浓度的PRP均具有促进正常成纤维细胞增殖的作用，且这种增殖作用表现为时间依赖性和浓度依赖性。

2.5 倒置相差显微镜下计数不同时间段内各组细胞数每孔细胞数 通过计数24 h与48 h各组细胞计数发现，对于正常细胞加入不同浓度PRP后细胞数量逐渐增加，在相同时间段内，细胞数量增加的倍数与浓度具有相关性。而对光老化进行中的细胞，只有1%PRP组细胞数量较单纯照射组细胞数量增加，5%PRP组与10%PRP组细胞数量较单纯照射组均减少，且后者细胞数量减少更多(图5)。

图1 不同浓度PRP对正常成纤维细胞增殖的影响(×40) a. 对照组 b. 1%PRP组 c. 5%PRP组 d. 10%PRP组 图2 不同浓度PRP对于光老化进程中成纤维细胞增殖的影响(×40) a. 对照组 b. 1%PRP组 c. 5%PRP组 d. 10%PRP组 图3 不同浓度PRP对光老化成纤维细胞增殖与形态的影响(×100) 图4 不同浓度PRP培养条件下正常成纤维细胞的生长曲线 图5 不同浓度PRP培养条件下每孔细胞数
Fig 1 Effect of PRP with different concentration on the proliferation of normal fibroblasts (×40) a. the control group. b. 1% PRP group. c. 5%PRP group. d. 10%PRP group. Fig 2 Effect of PRP with different concentration on the proliferation of photoaging fibroblasts (×40). a. the control group. b. 1% PRP group. c. 5%PRP group. d. 10%PRP group. Fig 3 Effect of PRP on the proliferation and form of photoaging fibroblasts (×100). Fig 4 Growth curve of normal fibroblasts at different PRP concentrations. Fig 5 Number of cells in each well at different PRP concentrations.

3 讨论

皮肤的光老化是外源性老化的主要形式，在皮肤的光老化进程中，成纤维细胞在形态与功能的改变起着重要的作用。PRP的构成具有特定的生物学比例，被认为是极具开发潜力的生长因子库。PRP被广泛应用于骨科、口腔科、胸外科以及整形美容等领域[6-11]。由于PRP取材简单，自体应用时不会发生免疫排斥反应，将其应用于光老化的研究具有极大的可尝试性。在该实验中我们发现,对于正常的成纤维细胞一定浓度范围内的PRP，能够明显促进细胞的增殖，这种增殖呈现浓度依赖性。而对于光老化的成纤维细胞，PRP促进细胞增殖表现为两方面：一方面，低浓度的PRP可以减少光老化引起的细胞凋亡，改善光老化引起的细胞形态与结构的变化;另一方面，较高浓度的PRP在成纤维细胞光老化的进程中反而会加速光老化细胞的凋亡。

上述实验结果提示，RPR在一定浓度范围内能够促进正常成纤维细胞的增殖，且对于正常成纤维细胞，即使继续增加PRP的浓度也并不会出现像光老化组成纤维细胞表现的肥大铺展的外观，这可能是由于PRP对于正常的成纤维细胞主要表现为促进细胞增殖的作用，而并不会出现如实验组中因增高PRP浓度而导致细胞凋亡的现象。因为研究证明，只有在光老化的成纤维细胞中才会高度表达TGF-β及其受体，且后者的表达与衰老表型相关[12]。而在光老化的成纤维细胞中，由于紫外线的照射对成纤维细胞产生的直接和间接损伤作用，因而引起细胞的衰老甚至凋亡；而适宜浓度的PRP能够改善光老化细胞的这种损伤，减少细胞的凋亡。较高浓度的PRP，光老化过程中的成纤维细胞之所以能起到一个加速其细胞凋亡的作用，这可能是由于紫外线引起细胞的衰老，会过度表达TGF-β1[12]。研究发现，在UVB诱导的人真皮成纤维细胞中，TGF-β1的基因表达水平明显增高，在加入了TGF-β1受体拮抗剂的实验中发现，TGF-β1受体拮抗剂组能够降低与衰老相关的β-半乳糖苷酶的染色阳性率。此外,该因子表达的增加会引起许多与衰老相关的基因表达，如p53、p21。而在加入了该因子的拮抗剂后，能够明显降低衰老基因的表达。这提示我们在光老化的真皮成纤维细胞中会高表达TGF-β1因子，该因子可能会促进衰老的进程。而PRP中含有丰富的TGF-β因子，在光老化的成纤维细胞中，会通过TGF-β因子相关通路加重UVB对真皮成纤维细胞的损伤。这可能是较高浓度PRP引起光老化细胞过度凋亡的原因。从上述结果我们发现,适宜浓度的PRP能够改善成纤维细胞的光老化进程，减少其凋亡，但过高浓度的PRP会促进细胞的凋亡。

然而，适宜浓度的PRP如何调节光老化皮肤的进展，并改善其衰老状态，以及如何在临床实际应用中寻找到一个合适的来源于自体的PRP浓度，并将其应用于自身光老化皮肤的治疗，仍需要进一步研究。

[1] Kohl E, Steinbauer J, Landthaler M, et al. Skin ageing[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2011,25(8):873-884.

[2] Chainiaux F, Magalhaes J, Eliaers F, et al. UVB-induced premature senescence of human diploid skin fibroblasts[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2002,34(11):1331-1339.

[3] Rittié L, Fisher GJ. UV-light-induced signal cascades and skin aging[J]. Ageing Res Rev, 2002,1(4):705-720.

[4] Anitua E, Andia I, Ardanza B, et al. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration[J]. Thromb Haemost, 2004,91(1):4-15.

[5] Zeng J, Bi B, Chen L, et al. Repeated exposure of mouse dermal fibroblasts at a sub-cytotoxic dose of UVB leads to premature senescence: a robust model of cellular photoaging[J]. J Dermatol Sci, 2014,73(1):49-56.

[6] Simman R, Hoffmann A, Bohinc RJ, et al. Role of platelet-rich plasma in acceleration of bone fracture healing[J]. Ann Plast Surg, 2008,61(3):337-344.

[7] Altan E, Aydin K, Erkocak O, et al. The effect of platelet-rich plasma on osteochondral defects treated with mosaicplasty[J]. Int Orthop, 2014,38(6):1321-1328.

[8] Cervelli V, De Angelis B, Lucarini L, et al. Tissue regeneration in loss of substance on the lower limbs through use of platelet-rich plasma, stem cells from adipose tissue, and hyaluronic acid[J]. Adv Skin Wound Care, 2010,23(6):262-272.

[9] 杨玲玲. 富血小板血浆对人原代脂肪来源干细胞增殖的影响[D]. 第二军医大学, 2014.

[10] 王婧薷, 刘宏伟, 付小兵. 几种再生医学技术在面部年轻化治疗中的应用[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(7):421-423.

[11] 高伟成, 陈小平, 林金德, 等. 自体PRP/PRF脂肪颗粒移植面部填充的回顾性临床分析[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(3):149-152.

[12] Debacq-Chainiaux F, Borlon C, Pascal T, et al. Repeated exposure of human skin fibroblasts to UVB at subcytotoxic level triggers premature senescence through the TGF-β1 signaling pathway[J]. J Cell Sci, 2005,118(4):743-758.

Effect of platelet-rich plasma on the proliferation of photoaging skin fibroblasts

JIAChuan-long,CHENLiang,YANGQing-jian,BIBo,LUYong-zhou,GUYu,ZHUJing-jng,ZHUNing-wen,LIUTian-yi.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

LIUTian-yi,E-mail：tianyiliucn@126.com

Objective To discuss the effect of platelet-rich plasma (PRP) with gradient concentrations on the proliferation of photoaging skin fibroblasts. Methods PRP was prepared by using two-step centrifugation. The photoaging model was established in mouse dermis by ultraviolet irradiation in vitro. The proliferation of normal fibroblasts and photoaging fibroblasts at different PRP concentrations were observed by using inverted phase contrast microscope. Growth curve of normal fibroblasts at different PRP concentrations measured by cck-8 method. Cell number was counted by cell counter at different periods. Results The number of normal fibroblasts at 1%, 5% and 10% concentration PRP were more than that in the negative control. The number of photoaging fibroblasts at 1% PRP increased, the number of apoptosis cells decreased while the number of photoaging fibroblasts at 5% and 10% PRP decreased, the number of apoptosis cells increased. Conclusion Within a certain range of concentrations of PRP, normal fibroblast cells promote cell proliferation, and this effect is dose-dependent. However, the photoaging fibroblasts showed different results. On the one hand, PRP at low concentration reduced cell apoptosis and increased the number of cells; on the other hand, PRP at high concentration accelerated the apoptosis and lower cell numbers of photoaging fibroblasts.

Platelet-rich plasma; Dermis; Fibroblasts; Photoaging; Cell proliferation

上海市卫生系统优秀学科带头人资助项目(XBR2011033)；国家自然科学基金(81272125;81301642)；国家高技术研究发展规划(863)项目(SS2014AA020705)

200040，上海，复旦大学附属华东医院 (整形外科：贾传龙，陈 亮，杨清建，毕 波，卢勇周，郭 妤，朱晶晶，刘天一；皮肤科：朱宁文)

贾传龙(1989-)，男，山东枣庄人，硕士研究生.

刘天一，200040，复旦大学附属华东医院 整形外科，电子信箱：tianyiliucn@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.015

R-322

A

1673-7040(2016)04-0234-04

2015-10-24)