PEEK/HA对成骨细胞(MG63)增殖分化的影响

任英华，艾红军，刘 学，倪 卓，王 杨，章立群



实验研究

PEEK/HA对成骨细胞(MG63)增殖分化的影响

任英华，艾红军，刘 学，倪 卓，王 杨，章立群

目的 研究纳米PEEK/HA复合材料对MG63细胞相容性的影响。方法 应用流式细胞仪技术研究不同组分的复合材料浸提液中MG63细胞增殖的情况；应用实时定量RT-PCR技术检测复合材料浸提液中MG63细胞特征性蛋白碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达情况。结果 流式细胞仪实验结果显示，4种浸提液中培养的MG63细胞，48 h后，均有稳定的增殖。10%HA/SPEEK/PEEK组增殖指数为59.3%，高于其他4组，差异有统计学意义。实时定量RT-PCR实验结果显示，4种材料的浸提液培养MG63细胞于14、21、28 d时成骨细胞特征性的蛋白ALP、COLI的DNA的量表达明显。10%nHA/SPEEK/PEEK组表达高于其他4组，差异有统计学意义。随着时间的延长，各组的表达均有所下降。结论 纳米PEEK/HA复合材料对MG63细胞有良好的生物相容性。

PEEK/HA复合材料； MG63成骨细胞； 细胞增殖

当今社会，由于肿瘤术后及外伤等造成骨缺损的患者越来越多，尤其是颌面部骨缺损，严重影响美观和功能，因此，人们对生物医用骨替代材料的需求日益增加。在临床上常用的骨替代材料是金属，金属可以提供良好的机械强度、优异的摩擦性和无毒特性[1]。然而，因其存在一些显著缺点，阻碍了其更广泛的医疗应用[2]。羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)具有极好的生物相容性和生物活性，但其机械强度比人类骨皮质差。聚醚醚酮(polyether ether ketone, PEEK)具有稳定的化学和物理性质[3]。然而，PEEK具有的生物惰性[4]使其应用潜力受到限制。因此，将HA与PEEK相混合，研制出性能优越的生物材料，是目前各国学者亟待解决的问题。自2014-2015年，我们采用实验室制备的PEEK/HA复合材料与MG63细胞共培养，检测材料对MG63细胞特征性蛋白可能造成的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 PEEK/HA生物复合材料(深圳大学化学实验室)；RPMI-1640(美国GIBCO公司)；胎牛血清(美国HYCLONE公司)；细胞周期检测试剂盒(碧云天)；Super M-MLV 反转录酶(北京BIOTEKE公司)；RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化有限公司)；RNase固相清除剂(天恩泽)；Powder琼脂糖(西班牙SPAIN公司)；2×PowerTaqPCRMasterMix(北京BIOTEKE公司)；SYBR Green(北京SOLARBIO公司)。超纯水系统(上海HEALFORC公司)；超速冷冻离心机(湖南湘仪公司)；CO2培养箱(上海力申公司)；倒置相差显微镜(麦克奥迪);电热恒温培养箱(天津泰斯特公司);流式细胞仪(美国BD公司);微量移液器(芬兰IOHIT公司)；紫外分光光度计(美国THERMO公司)。

1.2 流式细胞仪测定MG63细胞增殖指数 将对数生长期的MG63细胞制备成8 mg/ml的细胞悬液，去掉废液，加入1 ml的PBS清洗细胞1次后去掉，各组分别加入4种材料培养基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml。空白组加正常培养基，分别培养48 h后进行细胞周期检测。2000 r/min离心5 min收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，2000 r/min离心5 min收集细胞，小心吸除上清。加入预冷70%乙醇，4℃固定2 h。将固定后的细胞2000 r/min离心5 min收集细胞，弃去上清液，PBS清洗2次，2000 r/min离心5 min，弃上清液，每管细胞样品中加入500 μl染色缓冲液，缓慢并充分重悬。加入25 μl碘化丙啶染色液混匀后，加入10 μl RNase A，混匀。37℃避光温育30 min。冰浴避光存放，随即进行流式检测。

1.3 实时定量RT-PCR检测MG63细胞特征性蛋白的表达 在对数生长的MG63细胞中，分别加入4种材料培养基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml，空白组加正常培养基，分别培养14、21、28 d进行相关基因对的检测。采用Real-time PCR法检测MG63细胞内ALP和Ⅰ型胶原的基因表达情况。总RNA提取试剂盒(天根)提取样本总RNA，将得到的RNA样本进行反转录，利用TIANScript RT Kit(TIANScript cDNA第一链合成试剂盒)，对上步实验所得的RNA样本进行反转录，以得到对应的cDNA。电泳分析(引物序列见表1)。 本实验采用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。根据PCR摸索的条件并结合实验仪器，最终优化得到的荧光定量反应体系及反应条件如下。反应体系：cDNA模板1 μl,上下游引物(10 μM)各0.5 μl,SYBR GREEN mastermix 10 μl,用ddH2O补足至20 μl；反应条件：95℃10 min；95℃10 s,60℃20 s,72℃30 s,4℃ 5 min,循环40次。首先将引物稀释至10 μM或根据引物不同情况稀释。

表1 引物序列表

1.4 统计学处理 应用SPSS 14.0软件进行统计学分析。采用单因素方差加配对t检验法，分析MG63细胞增殖指数和MG63特征性蛋白的表达情况。所有的检测数据至少重复3次，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪的检测结果 流式细胞仪检测后，4种材料的浸提液培养MG63细胞48 h后,细胞周期结果见图1。MG63细胞维持良好的生长状态，增殖迅速，很少发生凋亡。其中10%HA/SPEEK/PEEK组的PrI为59.3%，显著高于其他组。SPEEK组高于PEEK组，高于空白组，低于HA组，差异不显著。PEEK组低于空白组，低于HA组，差异不显著。PrI为细胞增殖指数，PrI=(S+G2M)/(G01+S+G2M)。与空白组比较，P<0.05差异有统计学意义。

2.2 Real-time RT-PCR检测结果 4种材料的浸提液中，MG63细胞分泌ALP和Ⅰ型胶原的real-time RT-PCR检测结果见图2，3。P<0.05，与空白组比较差异有统计学意义。ALP：10%HA/SPEEK/PEEK组分泌的ALP高于其他组，与PEEK组差异有统计学意义。在14 d时与其他3组差异无统计学意义，在21、28 d时均略高于HA组，与其他两组差异有统计学意义；SPEEK/PEEK组在14、21、28 d均明显高于PEEK组，差异有统计学意义。略高于空白组，差异无统计学意义。在14 d时略低于HA组，在21、28 d时显著低于HA组。PEEK组显著低于空白组、HA 组。随着时间的延长，各组分泌的ALP有下降趋势，但差异无统计学意义。Ⅰ型胶原：10%HA/SPEEK组分泌的Ⅰ型胶原高于其他4组，并且差异有统计学意义。SPEEK/PEEK高于PEEK组，14 d时差异无统计学意义，21、28 d时差异有统计学意义。高于空白组低于HA组，差异无统计学意义。PEEK组低于空白组，差异无统计学意义。低于HA组，差异有统计学意义。随着时间的延长，各组分泌的COLI有下降趋势，但差异无统计学意义。

3 讨论

PEEK的机械性质接近人体皮质骨[5]。例如，PEEK的弹性模量大约8.3 GPa，人体皮质骨的弹性模量为17.7 GPa。比Ti合金(116 GPa)和Co-Cr合金(210 GPa)低得多(J Black, 1998年) 。然而，PEEK并没有明显的促进成骨的能力[6]，但具有一定的生物惰性，这一缺点限制了其的应用潜力。因此，如何提高PEEK的生物活性，使其能够充分实现潜在的显著效益，是一个必须解决的难题。目前，有两种主要方法已被用于改善PEEK的生物活性，包括表面改性和复合物的制备。表面改性大部分采用物理方法，化学处理是罕见的。只有湿化学处理或磺化处理可以用化学的办法对PEEK进行改性。因此，本文中提到的磺化PEEK具有材料的先进性。

本研究中的另一种材料纳米PEEK/HA复合物，是应用第二种方法来改善PEEK性能的，效果显著。纳米晶材料的典型特征是一微观结构的长度或粒径从几纳米到约100 nm。纳米晶体的HA颗粒具有独特的结构，与其微米尺寸对比[7]，显示出较高的机械强度和优异的生物相容性。HA纳米颗粒结合到聚合物基体，可以接近模拟天然骨的结构。人骨是一种HA纳米晶体和胶原纤维组成的生物复合材料。合成的纳米HA已被发现，可以促进成骨细胞的黏附和有效地增殖[8]。目前，可以使用多种技术来获得不同尺寸和形状的纳米HA，如化学共沉淀法、水热路线、胶束模板来合成溶胶-凝胶等[9-11]。因此，可以将纳米HA与PEEK相复合，以获得矫形承重的潜力材料。 PEEK的生物惰性通常会产生不理想的骨植入物的整合[12]，但其生物活性和生物相容性，通过增加纳米级别的HA可大大增强。有研究证明[13]，将纳米级别的HA添加到PEEK中，可以刺激成骨细胞活性，从而诱导更多的骨生长。通过模仿人体骨骼的结构和特性，进而研制纳米HA/PEEK复合材料。对其生物相容性进行探讨是现阶段研究的主要内容。

图1 流式细胞仪测试5组MG63细胞的增殖情况 图2 4组材料中MG63细胞ALP表达情况 图3 4组材料中MG63细胞Collagen Ⅰ表达情况
Fig 1 Proliferation of MG63 cell in 5 groups detected by flow cytometry. Fig 2 Expression of ALP of MG63 cells in 4 groups. Fig 3 Expression of collagen Ⅰ of MG63 cells in 4 groups.

结合本实验的结果，可以得出以下结论：4种PEEK复合材料浸提液中，MG63细胞均生长增殖良好。其中10%HA/SPPEK/PEEK浸提液组的MG63细胞的特征性蛋白表达最显著；其次是HA组；第三是SPPEK/PEEK组；最低是PEEK组。但随着时间的延长，特征性蛋白的表达均有所下降。为今后将纳米HA/PEEK复合材料早日应用于临床，起到了指导作用。

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Effects of PEEK/HA on proliferation and differentiation of MG63 cells

RENYing-hua,AIHong-jun,LIUXue,NIZhuo,WANGYang,ZHANGLi-qun.

(DepartmentofStomatology,ShenzhenNanshanPeople′sHospital,Shenzhen518052,China)

AIHong-jun,Email:13940066221@163.com;LIUXue,Email:xliu663@aliyun.com

Objective To study the effect of PEEK/HA composite materials on MG63 cell compatibility. Methods Flow cytometry(FCM) was used to study proliferation of MG63 in different components of the composite material leaching liquors. Real-time quantitative RT-PCR was adopted to detect the expression of proteins characteristic of alkaline phosphatase and type I collagen of MG63 cells in different components of the composite material leaching liquors. Results Flow cytometry results showed that MG63 cells cultured in the 4 leaching liquors at 48 hours had stable growth. The proliferative index in the 10% HA/SPEEK/PEEK group was 58.7% which was higher than that in the other three groups and the control group. The difference was statistically significant. Real-time quantitative RT-PCR results showed in MG63 cells cultured by 4 leaching liquors at 14 days, 21 days, 28 days, the expression of the characteristic protein ALP, and COLI of osteoblasts was obvious, especially in the 10% nHA/SPEEK/PEEK group which was higher than that in the other three groups and control group, the difference was significant. As time passed, the expression in each group has declined. Conclusion PEEK/HA composite materials have good biocompatibility with MG63 cells.

PEEK/HA composite material; MG63 Osteoblasts; Cell proliferation

深圳市科技计划项目(JCYJ20140411094009912)；深圳市南山区科技计划项目(2014003)

518052 广东 深圳，广东医学院附属深圳南山医院 口腔科(任英华, 刘 学, 王 杨, 章立群);中国医科大学附属口腔医院 修复科(艾红军)；深圳大学化学与化工学院(倪 卓)

任英华(1978-)，女，辽宁沈阳人，主治医师，博士研究生.

艾红军，110002，中国医科大学附属口腔医院 修复科，电子信箱：13940066221@163.com;刘 学，518052，广东医学院附属深圳南山医院 口腔科，电子信箱：xliu663@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.020

R318.08

A

1673-7040(2016)04-0252-04

2015-11-20)