急性白血病患者MSC的免疫原性及抑制异体T淋巴细胞增殖功能和机制研究

刘　珂　杜景霞　阮林海

(河南科技大学第一附属医院血液科，洛阳471003)



急性白血病患者MSC的免疫原性及抑制异体T淋巴细胞增殖功能和机制研究

刘珂杜景霞①阮林海

(河南科技大学第一附属医院血液科，洛阳471003)

[摘要]目的：研究分析急性白血病患者的骨髓间充质细胞(MSC)对异体T淋巴细胞增殖功能的抑制作用及其作用机制。方法：选取30例确诊急性髓细胞白血病(AML组)患者及30例急性淋巴细胞白血病(ALL组)，同期健康研究对象30例(健康组)，分离培养三组研究对象的MSC细胞，测定三组MSC细胞培养上清液中细胞因子的表达水平，采用Transwell培养检测三组MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用，采用混合淋巴细胞方法检测MSC对异体T淋巴细胞增殖的抑制作用。结果：AML组上清液中的TGF-β1、HGF水平显著低于ALL组和健康组(P<0.05)，ALL组的IL-11水平显著高于AML组、健康组(P<0.05)；三组间MSC上清液中IL-6的水平差异无统计学意义(P>0.05)。AML、ALL、健康组的MSC细胞分泌的细胞因子对T淋巴细胞增殖仍然具有显著的抑制作用，接触性共培养和不直接接触的情况下对T淋巴细胞增殖的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)；在加入MSC后，三组的T细胞增殖作用受到显著的抑制，在加入抗TGF-β1抗体、抗HGF抗体后T细胞增殖抑制作用较单纯加入MSC时明显降低(P<0.05)。 结论：急性白血病患者的MSC对异体T淋巴细胞增殖具有抑制作用，其作用原理可能与细胞因子的分泌有关。

[关键词]急性白血病；骨髓间充质细胞；异体；T淋巴细胞；增殖；抑制作用

骨髓间充质细胞(Mesenchymal cells,MSC)为具有潜在干细胞分化成熟能力的骨髓细胞，在定向诱导分化的情况下可以分化为骨、软骨、筋膜以及其他间质成分。MSC在骨髓中具有调节造血细胞分化、稳定造血速度以及原始早幼或者晚幼细胞的功能，对于正常的骨髓造血具有较为重要的意义。近年来，相关研究证实，MSC能够增加机体免疫耐受、抑制T细胞介导的异体源性免疫反应[1,2]，其机制可能与分泌不同细胞调节因子有关，但具体机制仍然不清。迄今为止对于骨髓异常造血情况下MSC能够参与免疫耐受的调节以及其机制的研究较少。急性白血病主要包括急性髓性、淋巴细胞性以及粒细胞性白血病，对于不同白血病的根治性治疗主要依靠异体骨髓移植。白血病异常病理造血情况下的MSC的免疫耐受的机制研究有利于延长骨髓抑制后抑制免疫排斥反应，具有广阔的临床应用前景[3]。本研究重在探讨MSC对异体T淋巴细胞增殖功能的抑制作用及其作用机制。

1资料与方法

1.1一般资料选取30例确诊急性髓细胞白血病(AML组)患者及30例急性淋巴细胞白血病(ALL组)，同期健康研究对象30例(健康组)，AML组30例，其中男18例、女12例，年龄21～58岁，平均年龄(35.4±11.6)岁，依据形态学、细胞学及免疫学分类标准：M1 5例、M2 9例、M3 8例、M4 3例、M5 5例。ALL组30例，其中男17例、女13例，年龄19～55岁，平均年龄(33.6±10.9)岁，其中L1 11例、L2 19例。健康组30例，其中男15例、女15例，年龄19～56岁，平均年龄(35.2±12.0)岁。

1.2实验方法

1.2.1MSC分离培养方法自髂后上棘抽取骨髓，加入淋巴细胞分离液，1 000 r/min离心20 min，获取全部单个核细胞，计数后接种于含40%MCDB、20 g/L血清的DF2培养液中，置37℃、5%CO2的培养箱中培养，24 h后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到80%融合时，应用胰酶/EDTA消化后，按照1∶3的比例传代。采用PRIM含10%的胎牛血清的培养基，加入尼龙柱内后采用培养基冲出非黏附细胞为T淋巴细胞，将MSC注入96孔板内，加入2×108L-1的T淋巴细胞100 μl，给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化。

1.2.2MSC上清液中细胞因子测定应用转化生长因子β1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素11(IL-11)和IL-6酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒，按照试剂盒说明书检测原代AML、不同代数ALL和正常成人骨髓MSC培养上清中上述细胞因子的水平。

2结果

2.1MSC的培养情况经过2周培养，AML组、ALL组及健康组均成功分离出MSC细胞，在倒置相差显微镜下观察，MSC细胞表现为梭形，均平行排列呈漩涡样生长，核仁明显，图1分别为AML组、ALL组及健康组的MSC培养后的MSC贴壁生长效果图。

2.2三组MSC上清液中细胞因子分泌情况AML组上清液中的TGF-β1、HGF水平显著低于ALL组和健康组(P<0.05)，ALL组的IL-11水平显著高于AML组、健康组(P<0.05)；三组间MSC上清液中IL-6的水平差异无统计学意义(P>0.05)。表1。

2.3MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用观察在不同数量的MSC细胞下，三组MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用见表2，AML组、ALL组及健康组三组的在MSC细胞数量逐渐增加的情况下，对T淋巴细胞的增殖抑制作用均逐渐增强，ALL组MSC对T淋巴细胞的增殖抑制作用与健康组基本一致，AML组MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用显著弱于ALL组和健康组(P<0.05)。

2.4MSC分泌细胞因子对T淋巴细胞增殖的抑制作用观察在Transwell培养的情况下，MSC细胞不能与T淋巴细胞进行直接接触，但是AML、ALL、健康组的MSC细胞分泌的细胞因子对T淋巴细胞增殖仍然具有显著的抑制作用，接触性共培养和不直接接触的情况下对T淋巴细胞增殖的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05,表3)。

2.5MSC细胞因子抗体对T淋巴细胞增殖的抑制作用观察在未加入MSC及细胞因子抗体的情况下，AML、ALL、健康组T细胞增殖作用差异无统计学意义(P>0.05)，在加入MSC后，三组的T细胞增殖作用受到显著的抑制，在加入抗TGF-β1抗体、抗HGF抗体后T细胞增殖抑制作用较单纯加入MSC时明显降低(P<0.05，表4)。

图1　MSC培养情况(×200)Fig.1　MSC culture(×200)Note: A.AML group；B.ALL group；C.Health group.

GroupsnTGF-β1IL-6IL-11HGFAMLgroup30358.62±36.9754.82±13.0878.14±11.082)220.74±65.17ALLgroup30568.91±55.481)59.17±14.05102.95±25.61650.18±114.911)Healthgroup30580.35±72.611)65.27±17.0388.25±17.052)641.87±120.861)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；compared with ALL group，2)P<0.05.

GroupsNoMSCgroup0.5×1041.0×1042.0×1045.0×104AMLgroup4.02±0.713.58±0.602.89±0.622)1.80±0.592)1.15±0.202)ALLgroup3.84±0.691.96±0.321)1.58±0.301)2)0.92±0.211)2)0.21±0.111)2)Healthgrou3.92±0.772.01±0.371)1.64±0.331)2)1.00±0.231)2)0.25±0.121)2)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；comparison with the the number of MSC cells was 0.5×104，2)P<0.05.

TranswellcultureNoMSCgroupAMLgroupALLgroupHealthgroupDirectcontact4.06±0.510.89±0.201)1.96±0.251)1.25±0.161)Contactcoculture4.12±0.600.91±0.221)1.92±0.231)1.20±0.191)t0.4170.3680.6451.12P>0.05>0.05>0.05>0.05

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05.

GroupsNoMSCMSCMSC+antiIL-11antibodyMSC+antiIL-6antibodyMSC+antiTGF-β1MSC+antiHGFantibodyAMLgroup4.06±0.641.12±0.201)1.18±0.191)1.16±0.201)2.91±0.411)2)3.42±0.451)2)ALLgroup4.11±0.811.01±0.191)1.14±0.171)1.10±0.211)3.02±0.471)2)3.35±0.511)2)Healthgroup4.14±0.751.20±0.221)1.23±0.241)1.25±0.241)2.98±0.451)2)3.47±0.481)2)

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05；compared with the addition of MSC，2)P<0.05.

3讨论

急性白血病患者骨髓造血异常，过度非正常白血病造血不仅导致机体参与抗感染等过程的细胞数量减少。同时其对于正常血细胞、血小板等造血功能的抑制，往往造成全血细胞减少的临床症状。重症白血病患者可以因重度感染、颅内出血以及继发性弥漫性血管内出血而死亡，异体骨髓移植为其治愈的唯一方式。抑制物抗宿主病是困扰骨髓移植的主要并发症，严重的抗宿主病将导致患者出现急性血管型或者细胞型免疫反应[4]，威胁白血病患者的生命安全。如何诱导免疫抑制、减轻抑制排斥反应是血液科医生关注的重要课题。虽然部分免疫抑制剂已广泛应用于骨髓移植后抗免疫排斥治疗，但其长期免疫诱导抑制的能力较弱，部分骨髓移植患者术后6个月之后出现了明显的排斥反应[5]。MSC不仅具有潜在干细胞分化功能，其对于造血细胞的免疫抑制、T淋巴细胞的共刺激抗原分子的沉默等作用[6]，还可在骨髓移植的同时进行MSC移植治疗[7,8]。但其治疗效果尚无大规模研究证实。病理状态下MSC对于淋巴细胞介导免疫的抑制作用以及相关机制的研究，对于骨髓移植具有极为重要的临床应用前景。

AML组、ALL组及健康组均成功分离出MSC细胞，在倒置相差显微镜下观察，MSC细胞表现为梭形，均平行排列呈漩涡样生长，细胞结构较为清晰，细胞核以及细胞膜周边膜性结构较丰富，提示了MSC的典型形态。三组分离培养的MSC细胞均能够贴壁生长，细胞增殖活性较高，在无造血细胞存在的情况下，可以呈现集落式生长。将自体骨髓MSC联合外周血造血干细胞移植，自体MSC可以促进受者造血，更为重要的是MSC对于移植物排斥反应的抑制作用，但并未对于不同移植数量级的MSC细胞进行细胞数量依赖性分析[9]。本研究发现，AML组、ALL组及健康组均成功分离出MSC细胞对于淋巴细胞增殖均具有明显抑制作用，在MSC数量逐渐增多的情况下，T淋巴细胞的增殖抑制作用均逐渐增强，提示了MSC对于淋巴细胞介导的免疫应答的诱导抑制作用。有趣的是，AML组MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用较弱，AML骨髓MSC不表达HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86和CIM0，其对于免疫诱导的抑制作用的下降可能与第一类以及第二类T细胞信号系统的免疫原性的下降有关[10]。骨髓增生极度活跃或明显活跃，骨髓中原始粒细胞占30%～89%(非红系)，早幼粒、中幼粒和成熟粒细胞比例较高，该病理特征的异常造血可能导致的免疫调控的病理改变[11]，但结论需要进一步证实。本研究发现，在Transwell培养的情况下，MSC细胞不能与T淋巴细胞进行直接接触，在接触以及不接触的情况下，三组MSC均具有明显的T淋巴细胞抑制作用，提示了MSC可能通过分泌细胞因子发挥抑制T淋巴细胞增殖作用的，如Song等[12]学者认为，MSC对于淋巴细胞增殖的抑制作用与TGF-β1有关。为了证实这一观点，本次研究加入抗TGF-β1抗体、抗HGF抗体后T细胞增殖抑制作用得到有效的逆转作用，表明MSC通过细胞因子发挥免疫调节作用，而TGF-β1和HGF是MSC发挥免疫抑制作用的主要分泌因子。

综上所述，急性白血病患者的MSC对异体T淋巴细胞增殖具有抑制作用，AML、ALL白血病患者骨髓MSC对于免疫耐受的诱导作用具有MSC细胞数量的依赖性，同时病理状态下MSC对于淋巴细胞的增殖抑制作用可能与TGF-β1和HGF等细胞因子的分泌有关。临床上对于符合骨髓移植治疗的白血病患者，在骨髓抑制的同时进行MSC细胞体外培养移植，可以诱导机体免疫耐受，而TGF-β1和HGF等细胞因子的外源性加入可能进一步加强MSC的抗免疫宿主病的作用，降低机体免疫排斥反应，具有较为广阔的临床应用前景，但需要大量以及长期的临床前期试验和论证。

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[收稿2015-10-09修回2015-11-18]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.028

作者简介：刘珂(1976年-)，女，主治医师，主要从事血液学方面的研究，E-mail：lllkkk_1976@sina.com。

中图分类号R733.71

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-1056-04

Study on immune function and mechanism of T lymphocyte proliferation in patients with acute leukemia MSC

LIU Ke，DU Jing-Xia，RUAN Lin-Hai.

Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

[Abstract]Objective:To study the inhibitory effect of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on the proliferation of allogeneic T lymphocytes in patients with acute leukemia and its mechanism.Methods: 30 patients with acute myeloid leukemia (AML),30 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL),and 30 healthy subjects (healthy group) were selected.MSC cells were isolated and cultured in three groups.The expression level of MSC cells in three groups were determined by MSC assay.The inhibitory effect of MSC on the proliferation of T cells was detected by Transwell assay.Results: AML group supernatant TGF-β1,HGF levels were significantly lower than the ALL group and the healthy group (P<0.05),significantly higher than the levels of IL-11 ALL group of AML group,healthy group (P<0.05); three groups MSC supernatant IL-6 levels difference was not statistically significant (P> 0.05).AML,ALL,MSC cells secrete cytokines healthy group of T lymphocyte proliferation still had a significant inhibitory effect,inhibition of differences in the case of contact and not in direct contact co-culture of T lymphocyte proliferation was not statistically significant (P> 0.05); after joining the MSC,T cell proliferation in the three groups was significantly inhibited upon addition of anti-TGF-β1 antibody,anti-HGF antibody after T cell proliferation effective than a simple reversal join MSC (P<0.05).Conclusion: MSC for acute leukemia patients inhibit allogeneic T lymphocyte proliferation,functioning principle may be related to the secretion of cytokines.

[Key words]Acute leukemia;Bone marrow mesenchymal stem cells;Allogeneic;T lymphocyte;Proliferation;Inhibition

①河南科技大学，洛阳471003。