TNFAIP8与胃癌耐药关系的初步研究①

李莉娜　毕志彬　王金胜

(长治医学院病理学教研室， 长治046000)



TNFAIP8与胃癌耐药关系的初步研究①

李莉娜毕志彬②王金胜

(长治医学院病理学教研室， 长治046000)

[摘要]目的：探讨TNFAIP8与胃癌耐药性的关系。方法：选取47例进行新辅助化疗患者手术前后的标本，免疫组化检测TNFAIP8蛋白的表达；Western blot检测胃癌细胞株SGC-7901及其顺铂耐药细胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表达差异，利用RNA干扰技术降低顺铂耐药细胞株中TNFAIP8的蛋白表达后，MTT检测其对顺铂的敏感性有无变化。结果：TNFAIP8在新辅助化疗前后的表达差异不大，在新辅助化疗无效组中的表达较有效组高(P<0.05)；SGC7901/DDP细胞中TNFAIP8蛋白的表达高于SGC7901细胞，siRNA-TNFAIP8质粒转染SGC7901/DDP细胞后蛋白表达显著下降，MTT结果显示降低TNFAIP8蛋白表达，细胞对顺铂的IC50较SGC7901/DDP显著下降(P<0.05)，敏感性提高。结论：TNFAIP8参与了胃癌的化疗耐药性。

[关键词]胃癌；TNFAIP8；耐药

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)，或称为SCC-S2、GG2-1、NDED，最先是在比较头颈部鳞癌细胞株和其对应的高转移细胞株中的差异蛋白里被确认的，TNF-α的刺激和NF-κB的活化可诱导其表达[1]。TNFAIP8通过抑制细胞凋亡来参与免疫过程、促进肿瘤的生长和侵袭转移[2]。由于TNFAIP8具有调控细胞凋亡的功能，我们分析其也可能影响肿瘤的临床治疗：放疗和化疗疗效，有研究显示在食管鳞状细胞癌中沉默TNFAIP8的表达后，可提高肿瘤细胞对铂类药物的敏感性[3]。有关TNFAIP8与胃癌化疗药物的耐药性研究报道较少，故我们通过检测了胃癌耐药细胞株中TNFAIP8的表达及利用RNA干扰技术，比较临床病例对胃癌新辅助化疗不同疗效组的TNFAIP8的表达来研究TNFAIP8与胃癌耐药性的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料与细胞系收集2012年1月～2014年12月47例长治医学院附属和平及附属和济医院病理科确诊为进展期胃癌患者的术前胃镜活检及术后标本蜡块。患者均适合进行术前新辅助化疗。男40例，女7例；年龄41～67岁，平均年龄60岁；高中分化26例，低分化21例；均发生淋巴结转移；临床分期：均为Ⅲ期。患者进行奥沙利铂联合氟尿嘧啶(Folfox方案)新辅助化疗2～3疗程后，根据化疗前后腹部CT增强扫描下瘤体大小及转移淋巴结的大小数目等分为新辅助化疗有效组和新辅助化疗无效组，有效组(术前化疗后完全缓解者2例或部分缓解者19例)21例，无效组(术前化疗后病情稳定者19例和病情进展者7例)26例[4]。人胃癌细胞株SGC7901同顺铂耐药细胞株SGC7901/DDP均购买于凯基生物公司。

1.1.2主要试剂胎牛血清、RPMI1640、0.25%胰酶均购自BI公司，MTT、RIPA购自康为世纪，顺铂购自Sigma公司，siRNA-TNFAIP8(序列1:CTGCGTGCGTTTCAGTGTTTAA，序列2:CGGTCTTGATATTGAGATAATA)及其阴性对照由上海吉凯基因有限公司构建合成。Lipofectmaine2000购自Invitrogen公司。TNFAIP8(15790-1-AP)、Tublin(10094-1-AP)购自Proteintech，免疫组化试剂盒PV-9000、DAB显色液购于北京中杉金桥。

1.2方法

1.2.1免疫组化手术前后的标本蜡块均进行4 μm切片，按照PV-9000试剂盒说明书操作，一抗TNFAIP8稀释浓度1∶100，枸橼酸高压修复3 min，操作过程中设立阴、阳性对照。结果判定[5]：阳性表现为细胞胞浆有着色，淡黄色1分，棕黄色2分，褐色3分；着色的范围，<25%为1分，>75%为3分，介于两者之间为2分，染色的强度和着色范围两分相加：<3分为弱表达，≥3为强表达。同张切片染色不均匀时，分区域计分平均。

1.2.2细胞培养胃癌SGC7901细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基，SGC7901/DDP细胞需培养基另加1 mg/L的顺铂维持耐药性，均置于37℃、5%CO2培养箱中，常规换液、传代。

1.2.3细胞瞬时转染取生长状态良好的SGC7901/DDP细胞种6孔板，第2天观察汇合度，转染步骤按照lipofectmaine2000说明书进行，siRNA-TNFAIP8质粒和对照质粒用量各为5 μl，lipofectmaine2000取7 μl，6 h后换液。24 h后观察转染效果。

1.2.4Western blot检测TNFAIP8蛋白的表达取生长状态良好的SGC7901及SGC7901/DDP细胞PBS洗涤后加RIPA冰上裂解约40 min，4℃ 12 000 r/min 离心30 min后取上清液，与5×上样缓冲液混合变性，12%SDS-PAGE电泳，每孔上样约10 μl，100 V稳定电压转膜80 min，5%BSA封闭1 h，1∶1 000稀释TNFAIP8抗体孵育，1∶5 000 Tublin 4℃过夜，1∶8 000二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗后ECL发光检测，经凝胶分析软件Alphaview SA分析，取TNFAIP8和Tublin表达条带的灰度值之比反映TNFAIP8的表达变化。顺铂耐药细胞转染48 h后同上方法处理细胞，提取蛋白，观察干扰效果。

1.2.5MTT法检测顺铂对耐药细胞及转染后细胞生长的影响取各组细胞104个到96 孔板，每组各重复5孔，设立调零和对照孔。细胞贴壁后，加入梯度浓度的顺铂，之后依照MTT操作步骤进行，于酶标仪在波长490 nm处检测吸光度(OD)值。计算抑制率、生存率和IC50值。

2结果

2.1新辅助化疗与胃癌组织中TNFAIP8蛋白的关系TNFAIP8蛋白主要位于癌细胞胞浆内，术后切除组织较术前的胃镜组织表达升高，但差异不明显(χ2=0.69，P=0.41)，且无论是新辅助化疗之前还是之后，化疗有效组即对药物敏感组中TNFAIP8的表达明显低于化疗无效组即对药物耐药组中的表达(图1，表1)。

图1　TNFAIP8蛋白在胃癌组织中的表达(免疫组化PV-9000，×200)Fig.1　Expression of TNFAIP8 in gastric carcinoma tissues(Immunohistochemistry PV-9000,×200)Note: A.High expression in chemotherapy invalid tissues；B.Low expression in chemotherapy effective tissues.

表1TNFAIP8蛋白的表达与新辅助化疗疗效的关系

Tab.1Relationship between expressions of TNFAIP8 and neoadjuvant chemotherapy effect

NeoadjuvantchemotherapyEffectCasesTNFAIP8expressionlevelHighLowχ2PBeforeValid217144.780.03Invalid26179AfterValid219124.410.04Invalid26197

2.2胃癌耐药细胞中TNFAIP8蛋白的表达两株细胞经MTT验证顺铂对其的细胞毒作用，SGC7901的IC50值为(2.39±0.26)mg/L，SGC7901/DDP 的IC50为(9.39±0.33)mg/L，Western blot结果显示胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表达明显高于其对照细胞株SGC7901。灰度值分别为 0.47±0.33、 0.74±0.35(图2)。

2.3转染结果Western blot检测显示在耐药细胞组、阴性对照组及TNFAIP8 siRNA 组的灰度值比分别为0.72±0.45、0.71±0.34、0.30±0.27，siRNA组较耐药组TNFAIP8蛋白下降明显(P<0.05)，阴性对照组和耐药组比较，无统计学差异(P>0.05)，表明利用siRNA技术降低了顺铂耐药细胞中的TNFAIP8蛋白的表达(图3)。

图2　WB显示两株胃癌细胞系中TNFAIP8蛋白的表达Fig.2　Western blot showed expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DDP cell Note: A.The expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DPP cell;1.SGC7901 cell;2.SGC7901-DDP cell;B.WB corresponding gray analysis diagram.

图3　WB显示转染后TNFAIP8蛋白表达情况Fig.3　Western blot showed expression of TNFAIP8 after transfection Note: A.The expression of TNFAIP8 after transfection,1.SGC7901-DDP group;2.Control group;3.siRNA group; B.WB corresponding gray analysis diagram.

图4　siRNA干扰TNFAIP8蛋白表达后SGC7901-DDP细胞对顺铂敏感性增加Fig.4　Susceptibility of SGC7901-DDP cell to cisplatin increased after siRNA

2.4不同浓度顺铂显示siRNA-TNFAIP8组对药物敏感性增强(图4)。耐药细胞、阴性对照组及siRNA组对顺铂的IC50值分别为(9.39±0.33)mg/L、(8.86±0.67)mg/L、(5.77 ±0.36)mg/L，与顺铂耐药细胞组比较，siRNA组IC50降低，细胞生存率显著下降(P<0.05)。说明在SGC7901/DDP细胞中干扰TNFAIP8的表达后可提高细胞对顺铂的药物敏感性。

3讨论

进展期胃癌的预后不好，其中对化疗药物耐药是困扰治疗的难题，筛选与耐药有关的基因有可能为治疗带来一定的疗效。新辅助化疗技术是根据患者的临床分期，术前选择化疗药物进行治疗，经过新辅助化疗后一部分患者可降期手术，效果较好；另外新辅助化疗的效果也可对术后的药物化疗做一定的疗效指导。为此我们选择了根据需要术前进行化疗即新辅助化疗的一些病例来判断TNFAIP8是否与化疗耐药有关。结果显示TNFAIP8术后的表达较术前高，但差异不明显，但其在新辅助化疗无效组即对化疗耐药组的表达明显高于化疗有效组即对药物敏感组(P<0.05)，提示TNFAIP8有可能参与了胃癌化疗耐受。术前的新辅助化疗疗效对术后的常规化疗药物选择有提示作用，故我们认为TNFAIP8蛋白的表达水平也对化疗疗效有提示。接下来我们又验证了在胃癌顺铂耐药细胞株中其的表达明显高于顺铂敏感细胞，利用RNA干扰技术降低耐药细胞中其表达后，对顺铂的敏感性显著提高，由此我们判断TNFAIP8在胃癌的化疗耐药中是起了一定作用的，这和Hadisaputri等[3]在食管癌细胞中的结论一样。Liu等在卵巢上皮癌的临床病例中也发现高表达的TNFAIP8对铂类药物的治疗抵抗[6]。

TNFAIP8是由TNF-α和转录因子NF-κB诱导，定位于胞浆内的蛋白，分子量为21 kD，FLIP家族成员[7]。因其结构上也含有死亡效应结构域，故能抑制Caspase介导的细胞凋亡。TNF-α诱导的TNFAIP8表达可被NF-κB的抑制剂IKB逆转，TNFAIP8的表达可抑制TNF-α诱导的NF-κB表达缺失的细胞凋亡，但TNFAIP8的相互作用蛋白和信号通路目前尚不清楚。之前在胃癌、乳腺癌、肺癌中和转移关系密切[8-10]；Zhang等[11]发现在多种高侵袭肿瘤细胞中TNFAIP8的表达沉默可引起与促进血管生长及侵袭相关的VEGFR-2、MMP的表达下调；TNFAIP8在肿瘤治疗中的意义尚不明确，在前列腺癌细胞中，研究者发现雄激素可诱导TNFAIP8的表达，利用裸鼠体内成瘤实验沉默TNFAIP8的表达后可增强放疗的敏感性及激素治疗效果[12]。

我们结果显示TNFAIP8能介导胃癌的耐药性，其是否影响了耐药相关蛋白、其的下游蛋白或信号通路是否参与对放疗的抵抗还需要继续研究。

参考文献：

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[收稿2015-10-11修回2015-11-17]

(编辑倪鹏)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.006

作者简介：李莉娜(1981年-)，女，硕士，讲师，主要从事消化道肿瘤研究，E-mail:lilina9825@163.com。 通讯作者及指导教师：王金胜(1976年-)，男，博士，教授，主要从事消化道肿瘤研究，E-mail:tigergv@163.com。

中图分类号R735.2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-0962-04

Preliminary research in relationship between TNFAIP8 and gastric cancer drug resistance

LI Li-Na,BI Zhi-Bin,WANG Jin-Sheng.

Department of Pathology,Changzhi Medical College,Changzhi 046000,China

[Abstract]Objective:To explore if there was a correlation between TNFAIP8 and gastric tumor drug resistance.Methods: We collected 47 cases of neoadjuvant chemotherapy,and detected the expression of TNFAIP8 in their tissues before and after surgery by immunohistochemistry.Compared the expression of TNFAIP8 between SGC7901 cell and its cisplatin resistance cell SGC7901-DDP by Western blot,and then we used siRNA technology to decreased its expression,continued to test the susceptibility to cisplatin through MTT.Results: The expression of TNFAIP8 between pre-neoadjuvant and after-neoadjuvant had no difference,but the expression of chemotherapy effectiveness was lower than chemotherapy invalidness(P<0.05);the expression of SGC7901-DDP cell was also higher than SGC7901 cell; the expression of TNFAIP8 decreased apparently through plasmid transfection of SGC7901-DDP cell,MTT test showed the fewer expression of TNFAIP8 could increase the susceptibility to cisplatin(P<0.05).Conclusion: TNFAIP8 was involved in chemotherapy resistance of gastric carcinoma.

[Key words]Gastric carcinoma;TNFAIP8;Drug resistance

①本文为山西省卫生计生委科研课题(2014140)和长治医学院科技创新团队项目(CX201407)。

②长治医学院附属和济医院普外科，长治046000。