反转录环介导等温扩增技术检测甲型H1N1流感病毒的建立

赵娜　刘金霞　孙殿兴

050082 石家庄，中国人民解放军白求恩国际和平医院全军肝病诊治中心(赵娜、孙殿兴)； 067000，承德医学院病原生物学实验中心(刘金霞)



·技术方法·

反转录环介导等温扩增技术检测甲型H1N1流感病毒的建立

赵娜刘金霞孙殿兴

050082 石家庄，中国人民解放军白求恩国际和平医院全军肝病诊治中心(赵娜、孙殿兴)； 067000，承德医学院病原生物学实验中心(刘金霞)

【摘要】目的 通过应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对甲型H1N1流感病毒进行基因检测，建立一种快速、简便的可视化核酸检测技术。 方法 先针对甲型H1N1流感病毒HA基因区段，设计2对RT-LAMP引物。通过检测不同病毒评估引物的特异性，通过检测倍比稀释的临床样本确定RT-LAMP的灵敏度。用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化检测，同时用凝胶电泳进行结果验证。最后用RT-LAMP检测临床样本，使用卡方检验比较与TaqMan PCR的一致性。 结果RT-LAMP的引物特异性好，可准确地使甲型H1N1流感病毒扩增。通过对稀释模板的检测，得出RT-LAMP的灵敏度为2.5×103拷贝/ml。RT-LAMP扩增结果可通过HNB可视化判定，与凝胶电泳的效果相当。对RT-LAMP和TaqMan PCR的显著性差异经统计学评价，可知二者一致性较好(P>0.05)。结论本研究实现了可视化检测甲型H1N1流感病毒，具有更好的灵敏性，该技术在基层医疗机构有一定的实用价值。

【主题词】甲型H1N1流感病毒；反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)；可视化

Fund program: Medicine and Hygiene Research Foundation of the Whole Army (CBJ 14C010)

甲型H1N1流感病毒(简称甲流)为单股负链RNA病毒,属于正粘病毒科,主要通过呼吸道传播，传播快，感染率高。人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、头痛、全身肌肉痛、鼻塞流涕等[1]。2009年开始，甲流在全球范围内大规模流行，虽然目前大规模流行已经结束，但为下个流行期做好准备，因此有必要使用一种较为简便的检测方法，便于在基层医疗机构监测人群中的感染状况。

目前，检测流感病毒的方法主要采用荧光定量PCR检测呼吸道标本(鼻/咽拭子、口腔含漱液、痰等)，但是该技术操作繁琐、对实验环境和操作人员要求高，不适用于在基层医疗机构应用。反转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术做为等温核酸扩增技术的典型代表，已被广泛应用于各种病毒的检测。其特点是在恒温(约65℃)条件下，利用针对靶序列的六段区域设计4条特异引物，在1 h内能将数个拷贝的RNA高效扩增到109～1010倍。该技术尤其适合推广到高端实验设备缺乏的基层医疗机构[2]。本研究使用RT-LAMP技术初步建立了甲流病毒的可视化检测方法，该方法具有在基层医疗机构的实用价值和推广前景。

表1　RT-LAMP引物序列

1材料与方法

1.1主要试剂病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNAMini Kits)购自德国Qiagen公司，M-MLV逆转录酶购自Vazyme公司，BstDNA聚合酶购自美国NEB公司，重组核糖核酸酶抑制剂购自TBZInvitrogen公司，羟基萘酚蓝(HNB)染料购自TBZSigma公司。

1.2模板来源收集2014年11月至2015年年初到本医院就诊的疑似甲流患者鼻咽分泌物，将咽拭子在稀释液中充分搅拌、挤压，使鼻咽分泌物充分溶于稀释液中待检。按照病毒核酸提取试剂盒操作说明提取RNA，提取物送检验科进行TaqMan PCR检测(使用美国CDC TaqMan PCR方法检测甲型H1N1流感病毒的引物和探针[3])，选择定量结果在1×103～1×106拷贝/ml的阳性样本55例(1×105～1×106拷贝/ml有样本18例，1×104～1×105拷贝/ml有样本16例，1×103～1×104拷贝/ml有样本21例)。另收集10例健康人鼻咽分泌物样本并按照上述方法进行检测(阴性)。甲流患者和健康人另经血常规和血生化等检查以确证TaqMan PCR结果。用来验证特异性的病毒：甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒均为标准株。所有样本提取物置于-80℃冰箱保存。

1.3引物设计NCBI网站下载甲流病毒HA基因区段，使用Clustal X软件进行序列对比，选取相对保守区域，使用Primer Explorer V4软件设计4条RT-LAMP引物(参考序列Genbank号：KU242680)。引物序列见表1，表中F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物。所有引物委托上海生工公司合成。

1.4反应体系和结果判定 25 μl体系包括：内引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜碱0.8 M，MgSO46 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，RNA模板1 μl，BstDNA聚合酶8 U、10×反应缓冲液2.5 μl，AMV 100 U，RNA酶抑制剂20 U，120 μmol/L HNB 1 μl，同时用双蒸水(ddH2O)补足至25 μl。将反应管(0.5 mL EP管)置于65℃水浴箱内反应约60 min。反应完成后用肉眼观察羟基萘酚蓝(HNB)的指示效果，阳性反应使体系呈天蓝色，阴性反应使体系保持紫色。同时取5 μl扩增产物在凝胶中电泳约40 min，然后置于凝胶成像系统下查看图像以验证HNB的指示效果。

1.5特异性实验应用RT-LAMP方法同时对甲流病毒的H1N1亚型、H3N2亚型、H5N1亚型、H7N9亚型、乙型流感病毒和副流感病毒进行扩增以验证引物的特异性，其中H1N1亚型重复扩增3次。

1.6灵敏度实验为了进一步确定RT-LAMP的检测灵敏度，选取TaqMan PCR定量结果约为2×104拷贝/ml的样本进行一系列稀释(稀释后分别为1.00×104拷贝/ml、5.00×103拷贝/ml、2.5×103拷贝/ml、1.25×103拷贝/ml和1×103拷贝/ml)后，分别用RT-LAMP扩增。将扩增产物进行凝胶电泳，根据紫外光下可见最高稀释度的电泳带确定扩增结果，同时用HNB进行结果对照，实验重复3次。

1.7统计学方法对55例临床阳性和10例阴性样本进行RT-LAMP扩增，和TaqMan PCR结果进行比较。应用SPSS 17.0软件进行卡方检验，P<0.05为显著性差异，具有统计学意义。

2结果

A.RT-LAMP产物电泳结果；B.HNB可视化检测。1～3：甲型H1N1流感病毒；4：甲型H3N2流感病毒；5：甲型H5N1流感病毒、6：甲型H7N9流感病毒；7：乙型流感病毒；8：副流感病毒；N：双蒸水阴性对照；M：1kb DNA marker图1　RT-LAMP检测甲流的特异性A. Electrophoresis pattern of RT-LAMP；B.Visualized detection by HNB.1-3:type A H1N1 influenza virus;4: type A H3N2 influenza virus;4:type A H5N1 influenza virus;6:type A H7N9 influenza virus;7:type B influenza virus,8:parainfluenza; N: negative control using ddH2O;M: 1kb DNA markerFig.1　Specificity of RT-LAMP for detection of type A H1N1 influenza virus

2.1特异性实验分别对甲流病毒和非相关病毒进行RT-LAMP扩增后，电泳实验结果如图1A所示，泳带1～3表示甲流病毒被扩增后，出现特征性的梯状条带；泳带4～8所示的对照病毒未见被扩增。本研究说明RT-LAMP引物的特异性较好，不受非特异模板的干扰。从扩增原理上解释，是只有这4条针对靶序列6个区域的特异引物同时识别靶序列才启动扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能完成扩增。

HNB染色效果如图1B所示，各管的排列顺序和图1A一致。通过比较，可知两种产物检测方法的效果相当，而通过肉眼观察更加简单方便。

2.2灵敏度实验RT-LAMP对一系列稀释样本的灵敏度实验结果如图2所示。由图2A可知，1～4泳带均发生扩增，到第4泳带以后没有发生扩增，可确定RT-LAMP的灵敏度为2.5×103拷贝/ml；染色效果如图2B，图中各管的排列顺序和上图一致，阳性反应均可见颜色改变，但不同稀释度样本的扩增产物的染色深浅差异不大。

A.RT-LAMP电泳结果；B.HNB可视化检测。1：病毒含量为2×104拷贝/ml；2：病毒含量为1×104拷贝/ml；3：病毒含量为5×103拷贝/ml；4：病毒含量为2.5×103拷贝/ml；5：病毒含量为1.25×103 拷贝/ml；6：病毒含量为1×103拷贝/ml；N：双蒸水阴性对照；M：1kb DNA marker图2　RT-LAMP检测甲流的灵敏度A.Electrophoresis pattern of RT-LAMP；B.Visualized detection by HNB.1: lanes of virus containing 2×104copies/ml; 2: lanes of virus containing 1×104copies/ml; 3:lanes of virus containing 5×103copies/ml; 4: lanes of virus containing 2.5×103copies/ml; 5: lanes of virus containing 1.25×103 copies/ml; 6:lanes of virus containing 1×103copies/ml;N: negative control using ddH2O;M: 1kb DNA markerFig.2　Sensitivity of RT-LAMP for detection of type A H1N1 influenza virus

2.3临床样本的检测用RT-LAMP法对55例临床阳性和10例阴性样本进行检测，结果病毒含量在104拷贝/ml以上的34例样本用RT-LAMP也检测为阳性，而用RT-LAMP只测出病毒含量在104拷贝/ml以下的样本17例，未检出的4例样本病毒含量均低于3×103拷贝/ml，RT-LAMP的检测灵敏度为92.73%。另10例临床阴性样本用RT-LAMP也均检测为阴性，RT-LAMP的特异性为100%。

将RT-LAMP和TaqMan PCR的结果进行配对卡方检验，P>0.05(P=0.125)，这说明虽然RT-LAMP比TaqMan PCR的灵敏度低，但是这两种方法没有显著性差异。

3讨论

由于RT-LAMP在可操作性、检测时间、设备要求等方面比其他检测技术具有更大的优势，所以国内外研究者也曾报道过利用该技术检测甲流病毒。然而，我们发现这些研究均存在些许不足：例如程思佳[33]等利用扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度和荧光染料SYBR Green I进行结果判定，对于微量扩增产物，利用肉眼判定浊度的方法主观性太强；而SYBR Green I属于核酸结合染料，因抑制扩增反应，所以要反应后开盖添加，这样做的结果是很容易造成核酸气溶胶污染，而且SYBR Green I 的指示效果比电泳检测的灵敏度低[4]。Lee等[5]所用的RT-LAMP技术虽然检测快速(20 min)，但是灵敏度较低，56例阳性样本中只检出46例阳性。

本研究所用的RT-LAMP技术相当于是在前人研究基础上的一种改进：(1)所用的HNB的指示原理是通过指示体系中的金属离子浓度的变化从而间接指示扩增结果，所以不抑制扩增，可以在反应前加入，而且配制简单[6]。(2)所用的RT-LAMP技术的灵敏度比类似文献报道的高[3, 5，7]，更有利于进行疾病的辅助诊断和流行病学调查。(3)由于反应在等温条件下进行，所以不需昂贵设备，仅用一台水浴箱即完成检测，设备简单。

然而，该RT-LAMP技术仍然存在不足之处：首先，本研究限于研究时间有限，所得样本的规模较小，无法避免小概率事件发生；第二，实验中发现HNB染料指示的从阴性(紫色)到阳性(天蓝色)的颜色改变有时并不很明显；第三，虽然使用HNB不开盖可防止污染，但是一旦发生气溶胶污染，将很难消除。因此，可以通过扩大临床样本量，使用特殊眼镜或仪器对HNB的颜色改变辅助判定，采用分区操作、试剂分装等方法补足RT-LAMP的不足。随着该技术的不断改进，必将出现从样本处理到结果判读一体化、自动化的便携式仪器和配套试剂，使RT-LAMP技术成为传染病的诊断和流行病学调查的常规检测工具。

4参考文献

[1]侯海燕, 杨鹏飞, 张敏会, 等. 一起甲型H1N1流感暴发疫情的流行病学和病原学分析. 中华实验和临床病毒学杂志, 2015,29:405-408. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.05.005

[2]聂凯, 滕智平, 曾毅, 等. 环介导等温扩增技术研究进展及其在病原检测中的应用. 中华实验和临床病毒学杂志, 2013,27:316-318.doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2013.04.025

[3]成思佳, 陈之遥, 初亚男, 等. 单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒. 分析化学, 2011,39:335-340. doi: 10.3724/sp.j.1096.2011.00335

[4]付文亮, 蔡欣, 查磊, 等. RT-LAMP检测甲型H1N1病毒核酸几种结果判定方法. 医学研究杂志, 2010,39:68-70. doi: 10.3969/j.issn.1673-548X.2010.05.023

[5]Lee MS, Shih HC, Lu JJ, et al. M-specific reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of pandemic (H1N1) 2009 virus. Eur J Clin Invest, 2011,41:434-441. doi: 10.1111/j.1365-2362.2010.02427.x

[6]Luo J, Xu Z, Nie K, et al. Visual detection of norovirus genogroup II by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye. Food Environ Virol, 2014,6:196-201. doi: 10.1007/s12560-014-9142-8

[7]王翔, 张骞, 张钫, 等. 甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用. 生物技术通讯, 2011,22:696-9,708. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2011.05.022

通信作者：孙殿兴，Email：sundianxing@hotmail.com; 刘金霞，Email：1158210524@qq.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.018

基金项目：全军医药卫生科研基金项目(CBJ 14C010)

(收稿日期：2015-12-14)

Establishment of reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification technique for detection of type A H1N1 influenza virus

ZhaoNa，LiuJinxia，SunDianxing

BethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang050082,China(ZhaoN，SunDX);ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China(LiuJX)Correspondingauthor:SunDianxing,Email：sundianxing@hotmail.com;LiuJinxia,Email：1158210524@qq.com

【Abstract】Objective To establish a rapid，simple and visualized nucleotide detection technique for type A influenza H1N1 virus using reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) Methods Two pairs of RT-LAMP primers were designed in accordance with the HA gene of type A H1N1 influenza virus. Then, the specificity of the primers was evaluated by detection of different viruses, and the sensitivity was confirmed by testing multiple proportional diluent clinical samples. Hydroxynaphthol blue(HNB) was used for visualized detection, at the same time, gel electrophoresis was used for verification. At last, clinical samples were detected by RT-LAMP, the consistency of RT-LAMP and TaqMan PCR methods was compared by chi-square test. ResultsThe 4 primers of RT-LAMP have good specificity, which can identify type A H1N1 influenza virus accurately. The sensitivity of RT-LAMP was 2.5×103copies/ml by detection of diluent samples. The products of RT-LAMP could be detected by HNB visually, and the results is consistent with gel electrophoresis methods. After evaluation of statistical difference of RT-LAMP and TaqMan PCR, we find no significant difference with the two methods(P>0.05). ConclusionOur study has realized visually detection of type A H1N1 influenza virus by RT-LAMP with better sensitivity, which has some practical value in the primary care hospitals.

【Key words】Type A influenza H1N1 virus; Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP); Visualization