应用CRISPR/Cas9系统靶向切割细胞内乙型肝炎病毒基因组的研究

鲁宇青　韩进超　丛旭　魏来　潘孝本

100044 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室



应用CRISPR/Cas9系统靶向切割细胞内乙型肝炎病毒基因组的研究

鲁宇青韩进超丛旭魏来潘孝本

100044 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室

【摘要】目的应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统，我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列(guide RNA, gRNA)。质粒pUC18-HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞，或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBV DNA的HepG2.2.15细胞或者HepDE19细胞系；并用慢病毒处理基于C57BL/6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR/Cas9切割可以抑制30%～50%病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率，可达70%～90%。以慢病毒体系处理HepG2.2.15或HepDES19细胞时，HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2.2.15细胞中的3倍。HBV复制小鼠模型在CRISPR/Cas9慢病毒处理后，血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论CRISPR/Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组，相对于整合于染色体的基因组，游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。

【主题词】肝炎,乙型；共价闭合环状DNA；CRISPR/Cas9；基因；抗病毒

Fundprogram:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81170386)

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)是双链嗜肝DNA病毒，其感染肝细胞后，病毒基因组在HBV核心蛋白介导下进入细胞核，可形成非整合型的微染色体，作为病毒转录和复制模板长期存在，是当前抗病毒治疗停药后复发及耐药发生的关键原因[1,2]。因此，彻底清除肝细胞内的HBV基因组也是达到慢乙肝治疗彻底治愈的根本措施。此外，HBVDNA可整合入肝细胞，这可能是肝癌发生的早期事件[3]。过去十余年来，基因编辑技术的发展为靶向基因功能的失活提供了技术上的可能。如锌指核酶技术、TALEN等基因编辑技术均曾尝试用于细胞模型或动物模型中靶向HBVDNA的切割[4,5]。但这类技术为基于蛋白多肽模板对特定基因序列的识别，在识别设计方面有较大难度，极大限制了其研究与应用。新近发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat) 引导的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑手段由于其设计和应用简便而成为最新的研究热点。此系统的工作原理为通过碱基配对与引导核酸酶Cas9 对配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，即可引导核酸酶Cas9 对DNA进行定点切割[6,7]。由于sgRNA设计简便，因此CRISPR/Cas9在基因编辑方面得到广泛的应用。在本研究中，应用CRISPR/Cas9系统和多种细胞模型，我们评估了其对不同形式细胞内HBV基因组的切割效应。

图1　靶向HBV基因的LentiCRISPR载体的设计及靶向序列Fig.1　The design and sequences of LentiCRISPR plasmids targeting at HBVgenome

1材料与方法

1.1质粒构建我们应用可表达hSpCas9 并转录sgRNA单载体表达系统lentiCRISPRv2(AddGene, 美国)构建靶向HBVDNA的CRISPR/Cas9慢病毒载体表达系统。据设计靶向位点所需的HBV基因组上的NGG模序、不同HBV基因型(B、C及D)中的该序列保守性及与宿主细胞染色体序列的差异性。如下图1所示，我们挑选了靶向HBV的C基因区靶序列合成相应的寡核苷酸(方框内序列，赛百盛，北京)。以无关序列CATCGATCGATCCTAGCTAG作为对照。质粒经限制性内切酶BsmBI酶切后插入带有酶切位点的寡核苷酸。lentiCRISPRv2载体结构、HBV基因组上的靶向区域及序列如下图1，所构建质粒的正确性由测序鉴定(诺赛基因，北京)，分别命名为LentiCRISPR-2004、LentiCRISRP-2144、LentiCRISPR-2414及LentiCRISPR-Con。所有质粒应用无内毒素质粒提取试剂盒进行提取(Qiagen，德国)。

1.2细胞系及慢病毒包装HEK293T细胞系及人肝癌细胞系HepG2在DMEM培养基中培养，整合了HBVDNA的HepG2.2.15及HepDES19细胞使用添加了380μg/mlG418 (Sigma，美国)的DMEM培养基(Gibco，美国)。包装慢病毒时，各lentiCRISPR穿梭质粒及包装质粒pVSVg、psPAX2按2∶1∶1比例混合，使用TurboFec转染试剂(Thermoscientific，美国)共转染HEK293细胞。在转染后第2、3天收取培养上清，采用PEG-8000沉淀方法浓缩沉淀病毒。病毒滴度采用Quicktiter慢病毒试剂盒(Cellbiolab，美国)检测。病毒收集后并存于-80度。

1.3细胞转染及慢病毒感染HepG2细胞接种于24孔板，细胞生长密度约50%时采用TurboFect转染试剂共转染pUC18-HBV1.2(我所构建保存)及单个或者多个LentiCRISPR质粒(LentiCRISPR质粒总量和pUC18-HBV1.2相同)。HepG2.2.15细胞及HepDES19细胞(美国Drexel大学郭巨涛教授惠赠)接种于24孔板，生长至密度约50%时以CRISPR/Cas9慢病毒(MOI=10)感染培养细胞。次日换培养基后继续培养至第3天取上清检测。

1.4HBVDNA及蛋白定量检测细胞培养上清中HBVDNA提取采用TIANamp病毒DNA提取试剂盒(天根生化，中国)。HBVDNA定量检测采用荧光实时定量PCR试剂盒(Qiagen，德国)方法，引物序列见文献[8]。细胞培养上清中HBV相关抗原及抗体采用电化学发光方法检测(Abbott，美国)。

图3　CRISPR/Cas9慢病毒处理HepDES19及HepG2.2.15细胞后培养上清中HBeAg检测(A)及HepG2.2.15细胞培养上清中HBV DNA检测(B).细胞以各CRISPR/Cas9慢病毒处理(MOI=10)，3 d后取上清检测(n=3)。两组之间数据配对t检验，* P<0.05 (n=3)Fig.3　Detection of HBeAg (A) and/or HBV DNA (B) in supernatant of HepDES19 and HepG2.2.15 cells treated with lentivirus CRISPR/Cas9. Cells were treated with the lentivirus at MOI of 10, and supernatant were collected on day 3. t-test was used for comparing of HBeAg between groups of HepDES19 and HepG2.2.15. * P<0.01 (n=3)

1.5慢乙肝动物模型6周龄的C57BL/6小鼠(维通利华公司，北京)通过尾静脉注射1×1010拷贝AAV-HBV1.3病毒(五加和分子医学研究所，北京)，以建立慢性HBV复制模型[9]。一个月后HBV稳定复制，通过尾静脉注射LentiCRISPR/Cas9nt2004,nt2144及nt2414慢病毒混合(各1×1011拷贝)。注射后0、4、8周小鼠面静脉丛取血样检测。

1.6统计学方法采用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析(SPSS，美国)，据数据特征采用t检验；P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1多位点CRISPR/Cas9切割显著提高抗HBV效率我们首先初步评估了CRISPR/Cas9系统对HBV蛋白表达抑制效应。基于HepG2细胞的LentiCRISPR和pUC18-HBV1.2质粒共转染实验结果显示：单位点的LentiCRISPR转染抑制了约10%～50%的病毒蛋白HBsAg和HBeAg的产生，但是多位点共转染显著提高了其抑制效应，尤其3个位点共转染组，其抑制效率可达到90%以上。

图2　HepG2细胞共转染pUC18-HBV1.2和LentiCRISPR-gRNAs质粒后培养上清中HBsAg检测。转染后第3天检测(n=3)。横坐标数字代表LentiCRISPR-gRNAs靶向的HBV基因组位置Fig.2　Detection of supernatant HBsAg in HepG2 cells co-transfected with plasmids pUC18-HBV1.2 and LentiCRISPR-gRNAs. Samples were collected on day 3 post transfection (n=3). The number in x-axis indicates the sites of HBV genome targeted by LentiCRISPR-gRNAs

图4　CRISPR/Cas9慢病毒处理HBV复制小鼠后血清中病毒蛋白检测.图A示C57BL/6小鼠在注射AAV-HBV1.3后可建立稳定的蛋白表达。图B示该小鼠模型建立后第4周为起点注射CRISPR/Cas9慢病毒(nt2004+nt2144+nt2414)后血清中HBsAg和HBeAg的变化Fig.4　Detection of serum HBV proteins in mice with HBV replication. C57BL/6 mice were injected with AAV-HBV1.3 virus to persistently yield viral proteins (A). The AAV-HBV1.3 mice (on weeks 4) were treated with CRISPR/Cas9 Lentivirus mixture(nt2004+nt2144+nt2414) detected for HBsAg and HBeAg

2.2CRISPR/Cas9对细胞核内HBVcccDNA切割效率高于染色体 为评估CRISPR/Cas9系统对细胞核内cccDNA的切割效应，我们应用了HepDES19细胞模型，该细胞系由于缺少包膜蛋白HBs，病毒核心颗粒无法分泌而使HBVcccDNA在细胞核内富集；此外，由于对插入HBV基因组的第一个“e”抗原起始密码子进行了突变，HBeAg只能由成环后的HBVcccDNA基因组的“e”抗原起始密码止开始转录产生。因此检测HBeAg水平可反应cccDNA水平和功能状况[10]。在HepG2.2.15细胞中，病毒蛋白的产生则主要来源于整合形式的HBV基因组。CRISPR/Cas9慢病毒处理HepG2.2.15细胞结果显示，单靶点切割仅约抑制了10%～30%的HBeAg水平，但对HepDES19的抑制可达50%～60%。显示相比于整合形式的HBV基因组，CRISPR/Cas9对cccDNA的抑制更高。

2.3CRISPR/Cas9可清除小鼠内HBV病毒蛋白表达注射AAV-HBV1.3的C57BL/6小鼠至第4周体内病毒蛋白表达稳定水平后，我们通过尾静脉注射CRISPR/Cas9慢病毒，结果显示注射后一周病毒蛋白水平可显著下降，一个月后可低至检测水平下限。但跟踪至两个月，未见HBsAb和HBeAb抗体的产生。

3讨论

虽然乙肝肝炎疫苗可有效的预防HBV感染，但目前对慢性HBV感染仍缺乏有效的治疗方案。只有约1/3的感染者对干扰素及核苷类似物有长期的病毒学应答，而HBV基因组在细胞内的长期存在是抗病毒治疗的主要难点。在本研究中我们尝试用新近发展的CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向HBV基因组进行切割。特别是应用了富集HBVcccDNA的HepDES19细胞系，证实了CRISPR/Cas9系统可通过基因编辑有效抑制cccDNA的功能和水平。

我们选择了HBV的C基因区作为CRISPR/Cas9的靶向切割位点，该区转录HBV的前基因组及核蛋白及e抗原。从切割效率来看，CRISPR/Cas9对质粒和HBVcccDNA的抑制效果较好，而对染色体DNA稍差，这可能是由于细胞核染色体外的游离DNA可能更容易sgRNA捕获所致。三个靶点同时切割可极大提高抑制效率，这与既往的类似研究一致[11-14]。有意思的是，虽然我们切割的靶向位点为C基因区，但HBsAg表达也可同样受到抑制。这可能是因为此区域所起始转录的3.5kb的RNA除了作为核心抗原及HBeAg的翻译模板，同时也是HBV前基因组RNA和聚合酶的翻译模板，这显然直接影响了HBV的复制和新cccDNA的形成，进而对所有病毒蛋白的表达产生影响。

本研究采用了8型腺相关病毒转导HBV到C57BL/6小鼠是近年发展的慢性HBV复制模型。相比于水动力高压注射HBVDNA质粒模型或HBV转基因模型，其对小鼠损伤小，基因组不整合，且表达病毒蛋白水平高；但目前多认为在小鼠中cccDNA并不能被检测到，HBV复制可能来源于所输入的病毒基因组[15,16]。在本研究中，CRISPR/Cas9系统也能有效的抑制病毒复制及蛋白表达，很显然sgRNA不能区分HBV或腺相关病毒的基因组。但有意思的是虽然病毒抗原在处理后一个月左右即可低于检测水平，但持续跟踪了两个月，小鼠体内并未检测到针对抗体。这与既往结果一致[17]。提示可能C57BL/6小鼠对HBV有天然免疫耐受，这也可能也是该小鼠模型能容许AAV导入的HBV建立持续HBV复制的原因。总之，随着基因治疗技术的发展，直接靶向清除细胞内的HBV基因组逐渐走向可能，CRISPR/Cas9技术显示了其在直接清除细胞内HBV基因组的巨大潜力。发展肝脏特异靶向和高效的CRISPR/Cas9转递系统，以及对脱靶效应的评估，是该技术走向应用的前提。

4参考文献

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通信作者：潘孝本， Email: panxiaoben@pkuph.edu.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.014

基金项目：国家自然科学基金(81370540)

(收稿日期：2015-10-17)

CleavageofintracellularhepatitisBvirusgenomebyusingofCRISPR/Cas9

Lu Yuqin, Han Jinchao, Cong Xu,Wei Lai, Pan Xiaoben

Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases; Beijing100044,China Corresponding author: PanXiaoben,Email: panxiaoben@pkuph.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo specifically cleave the intracellular HBV DNA using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 genome editing technology. MethodsUsing of Lenti CRISPRv2 system, we designed 3 highly conserved guide RNAs (gRNAs) to specifically cleave HBV genome. The cleavage efficacy of CRISPR/Cas9 targeting at HBV DNA in plasmids, the episomal HBV DNA or integrated HBV DNA in chromosome was evaluated in the cell cultures of HepG2.2.15 and HepDES19, and in a model of C57BL/6 mouse infected with AAV-HBV1.3. ResultsViral proteins were inhibited by 30%-50% by a single site CRISPR/Cas9 cleavagein the HepG2 cells transiently co-transfected with HBV DNA, multiple sites of cleavage significantly elevated the efficiency to 70%-90%. Compared with that of HepG2.2.15 cells, HBeAg in HepDES19 cells was inhibitedby at least three-fold higher. ConclusionMultiple sites cleavage significantly improve the efficacy of CRISPR/Cas9 systems,and this system is more efficient to cleave the extra-chromosome HBV DNA than the integrated HBV DNA in chromosomes.

【Key words】Hepatitis B; cccDNA; CRISP/Cas9;Genes; Antivirus