尖锐湿疣患者皮损中TLR7/9相关信号通路蛋白的表达

朱小霞　周强　程浩　韩睿　朱红明

315010， 宁波市第一医院(朱小霞、朱红明)；310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院(周强、程浩、韩睿)



尖锐湿疣患者皮损中TLR7/9相关信号通路蛋白的表达

朱小霞周强程浩韩睿朱红明

315010， 宁波市第一医院(朱小霞、朱红明)；310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院(周强、程浩、韩睿)

【摘要】目的探讨TLR7/9及其信号通路在尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)免疫发病机制中的可能作用。方法采用免疫组织化学SP法检测23例CA患者皮损TLR7/TLR9、IRF7和IRAK1的表达和分布情况，以13例边缘带正常皮肤的CA患者为对照，分别比较分析23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤，以及13例CA皮损与其边缘正常皮肤中TLR7/TLR9、IRF7和IRAK1表达密度和阳性率的差异。结果TLR9在表皮角质形成细胞和真皮乳头层部分单核样细胞胞浆内表达；TLR7、IRF7、IRAK1表达阳性细胞主要位于真皮乳头层，均为胞浆表达。尖锐湿疣患者皮损真皮乳头层TLR9表达阳性细胞密度和阳性率均比边缘正常皮肤明显增高(P<0.05)；TLR7、IRF7、IRAK1表达阳性细胞密度和阳性率与边缘正常皮肤无显著性差异(P>0.05)。结论尖锐湿疣患者皮损中TLR9的表达水平上调，而TLR7、IRF7、IRAK1的表达水平未见明显改变。推测：尽管尖锐湿疣皮损TLR9的表达上调，但TLR7/9下游通路未被有效激活，故而未能激活抗HPV免疫反应，进而HPV病毒清除困难，并可能与临床上尖锐湿疣的易复发或迁延不愈有关。

【主题词】尖锐湿疣；TLR7；TLR9；IRF7；IRAK1；乳头状瘤病毒，人

尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)是由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起的性传播疾病，发病机制不甚清楚。已有的研究表明，尖锐湿疣的反复难治可能与患者机体免疫功能低下或免疫调节紊乱导致免疫失衡有关[1]。浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cells，pDC)是皮肤组织中抗病毒免疫反应的重要DC之一，其特异性表达高水平TLR7(Toll-like receptor 7)和TLR9[2]，通过pDC/TLR通路介导分泌大量I型干扰素(IFN)，发挥抗病毒作用。本研究拟通过免疫组化法检测CA皮损中pDCs分泌的TLR7、TLR9及其信号通路中相关蛋白分子IRF7(Interferon Regulatory Factor 7)和IRAK1(Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1)的表达情况，探讨pDC及其TLR7/9信号通路在CA发病机制中的可能作用。

1材料与方法

1.1临床资料宁波市第一医院和浙江大学医学院附属邵逸夫医院于2012年10月至2013年8月收集的23例CA初发患者，符合2000年卫生部疾病控制司制订的CA诊断标准，且经组织病理证实为CA患者，其中女性10例，男性13例，年龄21岁～42岁，病程1周～2月。23例CA患者中有13例皮损边缘带正常皮肤，分别以23例CA皮损和13例边缘带正常皮肤的CA皮损为观察组，以13例边缘正常皮肤作为对照。所有病例均无糖尿病和严重肝肾功能异常，无免疫缺陷病史，无合并使用免疫抑制剂的疾病。本研究已经过相关伦理委员会审批及患者的知情同意。

1.2试剂TLR7鼠抗人单克隆抗体、TLR9鼠抗人单克隆抗体、IRF7鼠抗人单克隆抗体和IRAK1鼠抗人单克隆抗体均购自英国Abcam公司；即用型UltrasensitiveTMSP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化染色：取CA皮损组织，常规制成蜡块和切片。分别以TLR7鼠抗人单克隆抗体、TLR9鼠抗人单克隆抗体、IRF7鼠抗人单克隆抗体和IRAK1鼠抗人单克隆抗体为一抗，按免疫组化S-P试剂盒说明书进行染色，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)代替一抗作为阴性对照。染色后的切片在显微镜下观察并判断结果。

1.3.2结果判断：光镜下细胞膜和(或)细胞质呈现棕黄或黄褐色颗粒的细胞为阳性细胞。阳性细胞密度=5个视野阳性细胞总数/5个视野总细胞数；阳性率=含阳性细胞的病例数/总病例数×100%。

1.4统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，偏态分布计量资料用中位数M表示，两组间比较用秩和检验，计数资料比较采用χ2检验，显著性检验水平为0.05。

2结果

2.1CA皮损中TLR9的表达CA皮损真皮层有中等量炎症细胞浸润，主要位于乳头层，以单核细胞为主，边缘正常皮肤真皮层仅有少量炎症细胞(见图1)。比较23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤中TLR9的表达(见表1)，配对比较13例边缘带正常皮肤的CA皮损与其边缘正常皮肤中TLR9的表达(见表2)，发现表皮角质形成细胞胞浆内可见TLR9阳性表达，棘层为主，但染色强度较弱。

1A：CA真皮乳头层较多胞浆黄褐色单核样细胞；1B：CA边缘组织真皮乳头层少量胞浆黄褐色细胞；1C： CA皮损表皮各层角质形成细胞胞浆着棕黄色，棘层为主。图1　TLR9在CA皮损和边缘组织中的表达(SP×400)1A：More cytoplasmic brownish monocyte-like cells were observed in dermal papillary layer of CA lesions. 1B：Small number of cytoplasmic brownish monocyte-like cells were observed in papillary layer of CA normal borderline tissues. 1C：Many cytoplasmic brownish keratinocytes were observed in epidermis of CA, mainly in spinous layerFig.1　The expression of TLR9 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.2CA皮损中TLR7的表达TLR7阳性细胞少量表达于真皮乳头层，胞浆着棕色，表皮层未见明显阳性表达细胞(见图2)。比较23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤中TLR7的表达(见表1)。配对比较13例CA皮损与其边缘正常皮肤TLR7的表达(见表2)，23例CA皮损和13例CA皮损边缘正常皮肤中TLR7阳性细胞密度无显著性差异(P>0.05)。

2A：CA皮损真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞；2B：CA边缘组织真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞图2　TLR7在CA皮损和边缘组织中的表达(SP×400)2A：Few of cytoplasmic brownish cells were observed in papillary layer of CA lesions. 2B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissuesFig.2　The expression of TLR7 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.3CA皮损中IRF7的表达IRF7阳性细胞少量表达于真皮乳头层，胞浆着棕色，表皮层未见阳性表达细胞(见图3)。比较23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤中IRF7的表达(见表1)。配对比较13例CA皮损与其边缘正常皮肤IRF7的表达(见表2)，23例CA皮损和13例CA边缘正常皮肤中IRF7阳性细胞密度无明显差异(P>0.05)。

3A：CA皮损真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞；3B：CA边缘组织真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞图3　IRF7在CA皮损和边缘组织中的表达(SP×400)3A：Few of cytoplasmic brownish cells were observed in papillary layer of CA lesions. 3B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissuesFig.3　The expression of IRF7 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

2.4CA皮损中IRAK1的表达IRAK1阳性细胞少量表达于真皮乳头层，胞浆着棕色，表皮层未见阳性表达细胞(见图4)。比较23例CA皮损与其中13例CA皮损边缘正常皮肤中IRAK1的表达(见表1)，配对比较13例CA皮损与其边缘正常皮肤IRAK1的表达(见表2)。23例CA皮损和13例边缘正常皮肤中IRAK1阳性细胞密度无显著性差异(P>0.05)。

4A：CA皮损真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞；4B：CA边缘组织真皮乳头层偶见胞浆着棕色细胞图4　IRAK1在CA皮损和边缘组织中的表达(SP×400)4A：Few of cytoplasmic brownish brown cells were observed in papillary layer of CA lesions. 4B：Few of cytoplasmic brownish cells in papillary layer of CA normal borderline tissues. Fig.4　The expression of IRAK1 in CA lesions and their borderline tissues(SP×400)

3讨论

CA是由HPV感染引起的皮肤黏膜疾病，机体不能建立针对HPV感染有效的免疫应答是CA反复难治愈的主要原因。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的模式识别受体，在抗病毒的信号转导通路和免疫应答中发挥重要作用[3]。迄今为止，在人类已发现10余种TLR，包括TLR1～10[4]。其中TLR7和TLR9定位于细胞内，主要识别病毒核酸，它们可通过MyD88依赖途径，引发信号转导，活化NF-κB或干扰素调节因子家族(IRF7)，调节炎性细胞因子和I型IFN的表达，从而产生抗病毒反应[5]。pDC是皮肤组织中免疫反应的重要细胞之一，表达高水平的TLR7和TLR9，在抗病毒免疫反应中起重要作用。 pDC中参与TLR7/9信号传导通路的主要分子有IRAK1和IRF7等[6]。在某些病毒如单纯疱疹病毒[7]等感染过程中，pDC通过TLR信号传导通路介导分泌大量I型IFN来抑制病毒复制。与此相反，某些病毒如HPV-16[8]感染过程中，TLR信号通路未能有效激活，从而不能建立有效的抗病毒免疫反应，引起病毒的持续感染。

本课题组已有的研究[9]发现CA皮损中pDC密度和阳性率高于边缘正常皮肤，推测HPV感染影响局部粘膜的pDC数量，pDC可能参与了机体局部抗HPV感染的免疫反应。本研究发现CA患者皮损真皮层TLR9阳性细胞密度和阳性率高于边缘正常皮肤，说明随着pDC数量增加，TLR9水平上调，提示pDC分泌TLR9功能未受抑制。此外研究发现CA皮损表皮各层角质形成细胞内可见TLR9阳性表达，棘层为主，与茅晓红等[10]的研究结果一致，表明角质形成细胞亦可表达TLR9，在抗病毒免疫中也起一定作用。研究还发现CA皮损中TLR7阳性细胞密度和阳性率与边缘正常皮肤无显著性差异，提示CA皮损中TLR7未上调，说明pDC分泌TLR7功能未被明显激活，推测HPV感染可能抑制了pDC部分功能，与CA的发病和持续感染有关。用TLR7激动剂(如咪喹莫特)治疗CA有效提示TLR7功能激活有助于病毒清除。本研究还显示CA皮损中IRF7和IRAK1阳性细胞密度和阳性率与皮损边缘正常皮肤无显著性差异，提示即便TLR9表达上调但TLR7/9下游信号通路未能有效激活，导致pDC不能建立有效的抗HPV病毒免疫反应，从而引起HPV的持续感染及临床上CA的复发。HPV如何影响pDC的功能及其TLR通路有待进一步研究。

表1　23例CA皮损与13例边缘正常皮肤中阳性细胞密度和阳性率比较

标注(note)：M：中位数(median)U：秩和检验Z值(rank sum test Z value)

表2　13例CA皮损与其边缘正常皮肤中阳性细胞密度和阳性率比较

4参考文献

[1]朱宁, 程浩, 朱可建，等. 尖锐湿疣患者外周血Thl/Th2及Tcl/Tc2亚群的检测及意义. 中华实验和临床病毒学杂志, 2009,23:229-231. doi:10.3760/cma.j.issn. 1003-9279.

[2]Gilliet M, Cao W, Liu YJ. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleicacids in viral infection and autoimmune diseases. Nat. Rev Immunol, 2008, 8:594-606. doi: 10.1038/nri2358.

[3]Bowie AG, Haga IR. The role of Toll-like receptors in the host response to viruses. Mol Immunol, 2005, 42: 859-867. doi: 10.1016/j.molimm.

[4]Zhou Q，Zhu KJ，Cheng H. Toll-Like Receptors in Human Papillomavirus Infection. Arch Immunol Ther Exp, 2013,61:203-215. doi: 10.1007/s00005-013-0220-7.

[5]Boo KH, Yang JS. Intrinsic Cellular Defenses against Virus Infection by Antiviral Type I Interferon. Yonsei Med J, 2010, 51: 9-17. doi: 10.3349/ymj.2010.51.1.9.

[6]Beutler BA.TLRs and innate immunity. Blood, 2009, 113:1399-1407. doi: 10.1182/blood -2008-07-019307.

[7]Donaghy H, Bosnjak L, Harman AN, et al. Role for plasmacytoid dendritic cells in the immune control of recurrent human herpes simplex virus infection. J Virol, 2009, 83:1952-1961. doi: 10.1128/JVI.01578-08.

[8]Hirsch I, Caux C, Hasan U, et al. Impaired Toll-like receptor 7 and 9 signaling: from chronic viral infections to cancer. Trends Immunol, 2010, 31:391-397. doi: 10.1016/j.it. 2010.07.004.

[9]朱小霞, 周强, 程浩，等. 尖锐湿疣患者皮损中朗格汉斯细胞和浆细胞样树突状细胞的检测.中华皮肤科杂志, 2015,48: 343-345. doi: 10.3760/cma. j.issn.0412-4030.

[10]茅晓红, 张巍巍, 陈贤祯，等. Toll样受体在尖锐湿疣皮损中的表达.中华皮肤科杂志, 2010,43:637-640. doi: 10.3760/cma. j.issn.0412-4030.

通信作者：程浩， Email：hz_chenghao@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.007

基金项目：宁波市自然科学基金(2012A610218)；宁波市卫生局科研项目(2011B04)；国家自然科学基金(81301375)

(收稿日期：2015-10-28))

The expression of TLR7/9 and associated signaling pathway proteins in condyloma accuminatum lesions

ZhuXiaoxia，ZhouQiang，ChengHao，HanRui，ZhuHongming

NingboFirstHospital,Ningbo, 315010,Zhejiang,China(ZhuXX,ZhuHM)；SirRunRunShawHospital,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China(ZhouQ,ChengH,HanR)Correspondingauthor:ChengHao,Email:hz_chenghao@126.com

【Abstract】ObjectiveTo detect the expressions of TLR7/9, IRF7 and IRAK1 in condyloma accuminatum (CA) lesions and to investigate their possible roles in pathogenesis of CA. MethodsThe expressions of TLR7/9, IRF7 and IRAK1 in 23 cases of CA lesions were tested by immunohistochemistry. ResultsTLR9-positive cells were observed both in the epidermis and in the papillary layer of dermis. The density and positive rate of TLR9-positive cells in the papillary layer of CA lesions were significantly higher than those in their normal borderline tissues (P<0.05). TLR7-positive cells, IRF7-positive cells and IRAK1-positive cells were observed mostly in the papillary layer of dermis. There were no obvious difference of their density and positive rate between the CA lesions and their normal borderline tissues (P>0.05). ConclusionsThe TLR9 expression was up-regulated，while the TLR7, IRF7 and IRAK1 expression were un-changed in CA lesions. Our results suggested that the downstream of TLR7/9 signaling pathways in CA could not be provoked despite the up-regulation of TLR9 expression, which lead to the difficulty to HPV removal and the recurrence of CA.

【Key words】Condyloma accuminatum；TLR7；TLR9；IRF7；IRAK1； Papillomavirus； human Fund programs: The Natural Science Foundation of Ningbo(No. 2012A610218); Scientific research project of Ningbo Municipal Health Bureau(No. 2011B04); The National Natural Science Foundation of China(No. 81301375)