一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及鉴定

黄筱萍，刘　兰，熊大维，黄国昌

（江西省科学院 微生物研究所，江西 南昌330029）

一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及鉴定

黄筱萍，刘兰，熊大维，黄国昌

（江西省科学院 微生物研究所，江西 南昌330029）

从24株不同来源的酵母菌中分离筛选出一株对2-苯乙醇耐受性强、生物转化合成2-苯乙醇能力高的优良菌株SH003，该菌株能在含有4 g/L的2-苯乙醇培养基中生长，在优化的转化条件下，转化合成2-苯乙醇质量浓度达4.31 g/L，生成速率为0.18 g/（L·h），L-苯丙氨酸摩尔转化率为72.4%，经菌落特征、菌体形态分析、生理生化试验，结合18S rDNA序列分析，由系统发育树表明它与酿酒酵母亲缘关系最近，确定该菌株为Saccharomyces cerevisiae。

2-苯乙醇；酿酒酵母；菌株筛选和鉴定；18S rDNA

2-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE）是一种具有玫瑰花香的芳香醇，其作为主香和底香广泛应用于食品香精、化妆品洗涤产品等日化产品中。此外，它还是重要的医药中间体，是合成苯乙醇苷、羟基苯乙醇的前体，作为精细化工中间体用于合成苯乙烯［1］。目前，全球2-苯乙醇年产量近万吨，基本采用化学合成法生产。其产品大都含有难闻的有毒副产物，如联二苯、二氯代乙苯、氯二醇等。随着人们对天然香料的需求增多，从植物中主要是玫瑰精油中萃取获得的天然2-苯乙醇已远不能满足市场的需求。2-苯乙醇是微生物代谢产物，它是一些发酵食品如面包、葡萄酒、干酪的自然产物，采用微生物生产2-苯乙醇生产周期短、原料便宜，具有大规模生产的潜在能力，通过微生物发酵法生产2-苯乙醇已获得广泛关注。

酵母细胞合成2-苯乙醇途径主要有两条：一是通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径合成，二是通过艾氏途径（Ehrlich pathway），即L-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸，再脱羧形成苯乙醛后，经氧化脱氢作用生成2-苯乙醇，通过添加前体物质L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量大幅提高［2］。大多数酵母具有从头合成或转化L-苯丙氨酸为2-苯乙醇的能力，如马克斯克鲁维酵母［3］、发酵毕赤酵母［4］、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母及异常汉逊酵母等［5］，但通常产率较低，主要是严重的产物抑制成为酵母合成转化2-苯乙醇的瓶颈。因此筛选对2-苯乙醇耐受性好、转化率高的菌株成为国内外持续研究开发的关键。Etschmann M［6］等以工业废糖蜜为碳源，L-苯丙氨酸为前体，从14株酵母菌中筛选出2株高产菌，采用原位分离技术，2-苯乙醇产量达到3 g/L。Eshkol等［7］通过对Ye9系类菌种的筛选，得到2株对于2-苯乙醇耐受性高的菌株，在补料分批发酵72 h后，2-苯乙醇质量浓度达4.5 g/L。唐育岐等［8］从9株酵母菌中筛选出一株2-苯乙醇产量达1.688 g/L的酿酒酵母，通过培养基优化，2-苯乙醇产量达4.402 5 g/L。崔志峰等［9］采用紫外诱变等方法筛选出一株对2-苯乙醇耐受性和产量较高的酿酒酵母突变株，2-苯乙醇的耐受性和产率分别提高了50%和9.1%。王航等［10］从8株酵母菌株中2-苯乙醇产量达1.48 g/L的酿酒酵母，通过紫外诱变和原生质融合，获得一株2-苯乙醇产量达2.51 g/L的突变株。荣绍峰［11］筛选出一株酿酒酵母菌种，在优化的条件下2-苯乙醇产量达3.2 g/L，梅建风等［12］通过紫外诱变选育出一株酿酒酵母突变株，转化合成2-苯乙醇产量达5.4 g/L。通过从自然界中分离筛选酵母菌，以及从不同来源的酵母菌株中进行2-苯乙醇的耐受性的筛选和对L-苯丙氨酸转化合成2-苯乙醇能力的研究，筛选到一株对2-苯乙醇耐受性高、产率高的酵母菌株，并对它进行了鉴定。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1样品采集和菌种来源市售不同产地葡萄，酒厂泥窖，土壤，市售酵母干粉，外购菌种。

1.1.2培养基

1）斜面及保藏培养基（g/L）：麦芽汁琼脂培养基。

2）筛选培养基 （g/L）：葡萄糖30，酵母粉1，KH2PO45，MgSO40.2，2-苯乙醇2，琼脂粉 18；pH 6.5～6.7。2-苯乙醇于培养基灭菌后加入。

3）种子培养基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母粉3，麦芽汁3；pH自然。

4）初筛转化培养基（g/L）：葡萄糖60，酵母粉3，L-苯丙氨酸6，KH2PO45，MgSO40.2；L-苯丙氨酸于培养基灭菌后加入。

5）转化培养基（g/L）：葡萄糖100，酵母粉5，L-苯丙氨酸8；复合无机盐营养液2 mL。L-苯丙氨酸于培养基灭菌后加入。

1.1.3主要试剂L-苯丙氨酸：河北冀海生物科技有限公司，纯度99.5%；2-苯乙醇标准品：Sigma公司，纯度99.0%；甲醇：色谱纯；超纯水自制，其他试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器

Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，Agilent HC-C18反相色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），Olympus BX53显微镜，呈像系统DP80，Sartorius prachfum 224-1CN分析天平。

1.3实验方法

1.3.1酵母菌的筛选和分离纯化取不同来源的样品，分别接入含有2-苯乙醇的筛选培养基中，于28℃、180 r/min摇瓶培养24 h，取0.1 mL富集后的菌液进行梯度稀释度，涂布于筛选培养基平板中，于28℃培养24～48 h，挑选不同的单菌落划线纯化并镜检，将纯化的酵母菌接种麦芽汁斜面中，28℃培养48 h，4℃冰箱保存。

1.3.2种子液培养和生物转化从斜面菌种中挑取少量菌苔接种于30 mL种子培养液中，28℃、180 r/min培养24 h，再按10%的接种体积分数接种于含有L-苯丙氨酸转化培养液中，于28℃、200 r/min培养24 h，转化液于10 000 r/min离心10 min，上清液采用高效液相色谱法检测L-苯丙氨酸和2-苯乙醇质量浓度。

1.3.3酵母菌对2-苯乙醇耐受性试验斜面培养基灭菌后，加入2-苯乙醇使其在培养基中的质量浓度分别为0、1、2、3、3.5、4、5 g/L，用无菌量杯准确量取20 mL培养基，倒入直径10 cm的平皿中，制成厚度均一的筛选培养基平板。从待测菌株的斜面上取一环菌苔至含有玻璃珠的50 mL无菌水中，振荡均匀，制成菌悬液，稀释涂平板，于28℃培养3 d后进行菌落计数。

1.3.4反相高效液相色谱法测定L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量发酵液经10 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加纯水稀释1倍，用0.22 μm滤膜过滤。样品于HPLC分析，流动相为V甲醇∶V水=50%∶50%，流速为1.0 mL/min，检测波长260 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

1.3.5酵母菌形态特征及生理生化鉴定利用显微镜及观察固体平板上的菌落形态，并根据《酵母菌的特征与鉴定手册》［13］所列的酵母菌鉴定方法进行生理生化鉴定。生理生化鉴定主要为碳源同化、氮源同化和其它特定的生理生化试验等。

1.3.618S rDNA的扩增、测序和系统树的构建提取SH003菌株的基因组DNA，以引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGC AGGTTCACCTACGGA-3'）扩增18S rDNA。PCR反应条件：94℃5 min预变性；94℃30 s变性，54℃30 s退火，72℃2 min延伸，35个循环；72℃10 min延伸，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在北京诺禾致源生物信息科技公司完成测序。

将测序获得18S rDNA序列在NCBI核酸数据库中进行BLAST搜索，从数据库中获得高相似性的18S rDNA序列，下载相关菌种的18S rDNA序列，与供试菌株的序列一同用Clustal1.83软件进行多序列完全比对，结果采用MEGA5.2中的邻接法（Neihbor-Joining tree）进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析。

2结果与讨论

2.1生物转化合成2-PE菌株的初筛

从筛选平皿中挑选出24株菌株，经菌落形态和菌体形态观察，初步确定这些菌株均为酵母菌，分离纯化后，将这些酵母菌分别接种于初筛转化培养液中，于28℃、200 r/min培养24 h，以筛选合成转化2-苯乙醇能力较高的菌株，转化结束后，检测转化液中的2-苯乙醇质量浓度，结果见表1。

初筛结果表明，所分离的酵母菌合成转化2-PE的能力差异较大，有3株2-苯乙醇产量达2.5～3.2 g/L，13株2-苯乙醇产量为1.0～2.8 g/L，8株2-苯乙醇产量低于1 g/L。其中菌株SH003显示出最高的2-苯乙醇合成能力，其产量达3.15 g/L，转化率为70.74%。图1为菌株SH003的发酵上清液的HPLC图谱。

表1　　不同酵母菌株转化合成2-苯乙醇质量浓度和摩尔转化率Table 1　2-PE concentration and molar yield in screening process by different yeast

图1 菌株SH003转化液HPLC图谱Fig.1　HPLC of 2-phenylethanol from the transformed reaction solution of strain SH003

2.2菌株对2-苯乙醇耐受性试验

对产2-苯乙醇高于1 g/L的19株菌进行2-苯乙醇耐受性平板试验，在筛选培养基中加入1～5 g/L 的2-苯乙醇，分别用菌悬液涂布接种后，于30℃培养3 d。19株菌均能在含2 g/L的平皿中生长，在高于2 g/L的平板中其生长明显受到抑制，菌落变小，培养72 h有3株能在含3 g/L的2-苯乙醇平皿上生长，当质量浓度达到4 g/L以上时，基本上无菌落形成。菌株SH003在3.5 g/L的平板中生长良好，在4.0 g/L的平板上亦有少量菌生长，对2-苯乙醇的耐受性明显高于其它2株酵母菌。表2为对2-苯乙醇耐受性最强的3株菌株的结果。

表2　　不同2-苯乙醇质量浓度平板中酵母菌落数Table　2　Colony　forming　units　ofyeastin　dishes containing different concentration of 2-PE

2.3酵母菌株转化合成2-苯乙醇能力试验

将初筛中对2-苯乙醇耐受性较高，转化能力较高的3株酵母菌株，接种于转化培养基，于28℃、200 r/min培养24 h，2-苯乙醇产率见表3。

表3　　不同酵母菌株转化合成2-苯乙醇质量浓度和摩尔产率Table 3　2-phenylenthanol concentration and molar yield by different yeast

在提高转化培养基中L-苯丙氨酸底物质量浓度和葡萄糖质量浓度后，各菌株转化合成2-苯乙醇质量浓度均有很大提高，其中对2-苯乙醇耐受性最高的菌株SH003产率最高，产2-苯乙醇质量浓度达4.3 g/L，摩尔转化率达72.4%。这表明菌株对产物的耐受性越高，其生物转化合成2-苯乙醇的能力越强。

2.4菌株形态特征观察

菌株SH003在麦芽汁琼脂平板中于28℃培养48 h，其菌落形态和菌体形态特征见图2及表4。

图2　　酵母SH003形态特征Fig.2　Morphologic characteristic of yeast SH003

表4　酵母SH003的形态特征Table 4　Morphology characteristics of yeast SH003

2.5生理生化鉴定

根据《酵母菌的特征与鉴定手册》和《食品微生物实验技术》等相关方法，生理生化鉴定主要进行了碳源同化、氮源同化和其它生理生化实验，采用广东省微生物研究所购买的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GIM2.45（ATCC AS2.119）作为模式种，每个菌株分别作3个重复，结果见表5。

表5　S.cerevisiae GIM2.45与菌株SH003部分生理生化特征Table 5　Some physiological and biochemical characteristics of S.cerevisiae GIM2.45 and strain SH003

菌株SH003碳源同化实验中棉子糖同化为阳性，而菌株Saccharomyces cerevisiae GIM2.45棉子糖同化为阴性，其它生理生化特性均相同，从鉴定手册中亦列举了部分酿酒酵母可利用棉子糖。

2.618S rDNA序列分析

测序结果表明，该菌株18S rDNA序列共1 039 bp。在NCBI中进行BLAST，结果表明，它与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的18S rDNA序列同源性最高，达99.0%。菌株SH003的18S rDNA序列与S.cerevisiae MA09AN菌株的序列只有3个碱基的差别。用ClustalX+MEGA5.2建立SH003的系统发育树，结果见图3。可以看出，菌株SH003与S.cerevisiae KMS0510和 S.cerevisiae MA09-AN同源性最高，可以确定酵母菌SH003归属于S.cerevisiae。

图3　　基于菌株SH00318S rDNA基因构建的系统进化树Fig.3　Phylogenetic tree of stain SH003 on its 18S rDNA

3结语

酵母菌在自然界分布广泛，很多酵母菌都有转化生成2-苯乙醇的能力，但不同酵母菌株中转化合成2-苯乙醇的能力差别很大。从不同产地的市售葡萄、酒厂窖泥、市售干酵母中分离出的17株酵母菌和不同来源的7株酵母菌中筛选到3株转化合成2-苯乙醇能力较高的菌株，通过对2-苯乙醇耐受性和对2-苯乙醇合成能力测试，发现酵母菌对2-苯乙醇的耐受性越强，其转化合成2-苯乙醇的能力越高，为从自然界中快速分离获得2-苯乙醇高产菌株提供一种高效便捷的方法。从葡萄果皮中分离的菌株SH003对2-苯乙醇的耐受性最强，在含有4 g/L 的2-苯乙醇培养基中亦能生长，在L-苯丙氨酸底物质量浓度为8 g/L时，转化合成2-苯乙醇质量浓度为4.31 g/L，生成速率为0.18 g/（L·h），摩尔转化率为72.4%，该菌株的成功选育为后续生物转化合成2-苯乙醇的研究和生产提供了很好的菌种来源。

通过形态学、生理生化鉴定，菌株SH003的形态学特征和生理生化特性均与酿酒酵母相符，通过18S rDNA序列分析，菌株SH003与酿酒酵母同源性最高，可确定其为酿酒酵母。

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Screening and Identification of High-Yield Strain for 2-Phenylethanol

HUANG Xiaoping，LIU Lan，XIONG Dawei，HUANG Guochang
（Institution of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029，China）

A strain designated as SH003 with high 2-phenylethanol tolerance and bioconversion properties was selected from 24 yeast strains with different sources.It could grow in the medium containing 4 g/L 2-phenylethanol.Under the optimized conditions，the production and productivity of 2-phenylethanol respectively reached to 4.31 g/L and 0.18 g/（L·h）.The molar conversion rate of L-phenylalanine to 2-phecylethanol was 72.4%.Identified by the morphological and physiological characteristics and its 18S rDNA sequence，strain SH003 was closely related with Saccharomyces cerevisiae on phylogenesis.

2-phenylethanol，Saccharomyces cerevisiae，screening and identification，18S rDNA

TQ 92

A

1673—1689（2016）05—0531—06

2014-11-14

江西省重点科技支撑计划项目（20133BBE50018）；江西省科研院所基础设施配套项目（20151BBA13031）。
*

黄筱萍（1965—），女，江西南昌人，理学硕士，研究员，主要从事生物发酵、活性物质提取精制方面的研究。Email：plahxp@163.com