利用玉米秸秆生产单细胞蛋白关键技术研究

何 欢, 吕 美, 甄广田, 肇立春

(1. 沈阳市粮油食品科学研究所 科研信息室, 沈阳 110025;2. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034)



利用玉米秸秆生产单细胞蛋白关键技术研究

何 欢1, 吕 美1, 甄广田1, 肇立春2

(1. 沈阳市粮油食品科学研究所 科研信息室, 沈阳 110025;2. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034)

以农作物副产品玉米秸秆为研究对象,采用水解纤维素性能优良的绿色木霉(13001)及高产蛋白质的产朊假丝酵母(1769)为发酵生产菌株共同处理,生产蛋白质含量较高,富含多种矿物元素的单细胞蛋白产品。探讨了玉米秸秆预处理方法、绿色木霉接种工艺、纤维素降解工艺、不同氮源对玉米秸秆发酵糖化的影响,以及单细胞蛋白发酵工艺,通过对比试验确定了玉米秸秆最佳的预处理方法为粉碎后加入氨水对玉米秸秆进行预处理、接种6%绿色木霉(13001)产酶效率最高、添加15%纤维素酶曲水解24 h纤维素水解最完全、加入氯化铵作为氮源发酵糖化效果最好,通过正交试验确定了单细胞蛋白发酵的最适工艺条件为加入3倍水,温度控制在29～31 ℃,起始pH控制在5.5左右,发酵时间48 h左右。

玉米秸秆; 绿色木霉; 产朊假丝酵母; 单细胞蛋白

0 引 言

蛋白质是人体必需的营养物质,更是生命的物质基础,是构成细胞的基本有机物[1]。而世界蛋白质资源缺乏的问题已存在多年,生物技术开发新型蛋白是解决这一问题的重要途径[2]。另外,由于人们对资源的破坏性开采和利用,对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开[3]。玉米秸秆是农作物的副产品,是一种可以综合利用的重要的生物资源[4]。我国是农业大国,年产农作物秸秆达6亿吨[5]。随着我国农业生产和农村能源事业的发展,剩余秸秆的处理问题日渐凸显。农民采取简单焚烧或随意堆积,这种处理方式不但浪费了自然资源,还带来了各种危害,如造成空气污染、土壤结构破坏和交通事故频发等,对人类健康和周围动植物的生态环境造成严重影响,这对于资源的合理利用和环境保护都是极为不利的[6]。因此,利用生物技术处理玉米秸秆研制开发新型蛋白质产品,不仅解决了农作物副产物低价利用的问题,而且减少了由于焚烧玉米秸秆产生的二氧化碳,同时可以缓解世界蛋白质资源缺乏的现状[7]。本文着重对玉米秸秆发酵生产新型蛋白产品—单细胞蛋白的工艺技术进行了研究,以期研究开发出蛋白质含量高、营养丰富的新型蛋白产品,为我国单细胞蛋白工业化生产提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

绿色木霉13001:中国工业微生物菌种保藏管理中心提供;产朊假丝酵母1769:中国工业微生物菌种保藏管理中心提供;玉米秸秆,麸皮,琼脂粉,硫酸铵,稀硫酸,NaOH,氨水,氯化铵,硝酸铵,蛋白胨,酵母浸膏等均为市售。

DHP型恒温培养箱:上海精密仪器仪表有限公司;EHG-B型摇床培养箱:江苏金坛市亿通电子有限公司;FW100型粉碎机:上海楚定分析仪器公司;ES-315型高压灭菌锅:上海赛洋实业;SC-3614型离心机:安徽中科中佳仪器公司;HS.Z68.5型蒸馏水发生器:北京科学仪器;101A-2型数显鼓风干燥箱:吴江新亿阳烘箱制造厂;MZB-35型糖度计:上海米青科实业有限公司;PHS-3C型酸度计:上海雷磁仪器厂;接种环等。

1.2 测定方法

蛋白质的测定:GB 5009.5—2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定第一法规定的方法测定[8]。

还原糖的测定[9]:3,5-二硝基水杨酸比色法。

纤维素酶活的测定:以新华定量滤纸50 mg/份、羧甲基纤维素钠510 mg/份、脱脂棉花50 mg/份为底物,分别对应FPA、Cx、β-glucosidase,采用DNS还原糖法测定纤维素酶活[10]。酶活单位的定义为:1 min由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

1.3 工艺流程

1.3.1 纤维素酶曲制备工艺流程

首先接种绿色木霉(13001)制备纤维素酶曲,工艺流程如下:

绿色木霉→斜面培养基→孢子悬浮液↓培养基配料→灭菌→冷却→培养→纤维素酶曲

1.3.2 发酵工艺流程

在处理后的玉米秸秆粉中加入一定比例的纤维素酶曲,并接种产朊假丝酵母(1769)进行单细胞蛋白制备,工艺流程如下:

纤维素酶曲↓玉米秸杆→预处理→处理后秸杆粉→接种→发酵→单细胞蛋白↑产朊假丝酵母→培养→液体菌种

2 结果与分析

2.1 原料预处理

玉米秸秆粉碎后,过20目筛,分别采用氢氧化钠、稀硫酸、氨水进行处理,结果如表1所示。

表1 玉米秸秆预处理结果对比表Tab.1 Contrast table of Maize straw pretreatment results

由表1可知,通过氢氧化钠、稀硫酸、氨水的处理后,玉米秸秆分别有不同程度的水解,这种水解有助于后续水解发酵反应;氨水处理后反应液得糖率最高,稀硫酸处理最低,这是因为氨水在处理反应过程中,不仅能够中和玉米秸秆中潜在的酸性,还可以使更多的木质素成分分解,得到更多的糖,而且从经济及环保角度考虑,酸处理和强碱处理对设备的耐腐性要求较高[11],还会对环境造成污染,氨水腐蚀性小,价格便宜,适合工业化大规模生产,并且氨水预处理后的液体还可以在后续发酵反应中再利用,节省氮源,减少对环境污染,综合考虑,最终选择氨水对玉米秸秆进行预处理。

2.2 绿色木霉(13001)接种量对产酶效果的影响研究

图1 木霉接种量对产酶的影响Fig.1 Effect of trichoderma inoculatin volume on enzyme production

在三角瓶中按2∶1的比例加入玉米秸秆和麸皮,加入2%的(NH4)2SO4,分别接种绿色木霉孢子悬浮液2%、4%、6%、8%、10%,在30 ℃条件下培养72 h后测定酶活,实验结果如图1所示。

由图1可以看出,随着绿色木霉接种量的增加,酶活逐渐升高,当绿色木霉接种量超过6%时,酶活开始下降,这主要是由于接种量过大,会使反应液中微生物的数量过多,造成曲温升高的过高,不利于反应液中的微生物正常生长和产酶。因此,本实验最终选择的绿色木霉(13001)接种量为6%。

2.3 纤维素酶对玉米秸秆纤维素降解的研究

在玉米秸秆粉中分别加入纤维素酶曲5%、10%、15%、20%、25%,在55 ℃、pH值为5.0条件下[12],水解12、24、36、48、60、72 h,考察对玉米秸秆中粗纤维的降解率,实验结果如表2所示。

表2 纤维素酶对玉米秸秆中粗纤维降解的研究Tab.2 Tresearch on Cellulose enzyme decomposition of crude fibre in the maize straw

由表2可以看出,当纤维素酶曲添加量为15%,降解24 h以上,玉米秸秆中的粗纤维得到最大程度的降解,从生产工艺与经济的角度考虑,本实验最终选择添加15%纤维素酶曲,水解24 h。

2.4 不同氮源对玉米秸秆发酵糖化的影响研究

玉米秸秆中是不含氮素营养的[13],所以本实验在玉米秸秆发酵糖化之前分别加入硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、硝酸铵和酵母浸膏,并以经过氨水预处理不加其他氮素营养的玉米秸秆为对照,观察这5种氮源对玉米秸秆发酵糖化的影响,实验结果如表3所示。

表3 不同氮源对玉米秸秆发酵糖化的影响结果Tab.3 The influence results of different nitrogen source on maize straw saccharification fermentation

由表3可以看出,加入蛋白胨产生的还原糖最多,加入酵母浸膏的次之,加入氯化铵发酵糖化仅比上述2种有机氮源略少,从降低生产成本角度考虑,本实验最终选择氯化铵为最佳氮源。

2.5 产朊假丝酵母发酵实验结果分析

2.5.1 酵母接种量对产蛋白的影响

图2 酵母接种量粗蛋白含量的影响Fig.2 Effect of yeast inoculation volume on crude protein content

分别接入5%、10%、15%、20%的产朊假丝酵母进行发酵实验,经过48 h后,测定发酵液中蛋白的含量,实验结果如图2所示。

由图2可以看出,随着产朊假丝酵母接种量增加,产生蛋白的量随之增加,当接种量达到10%～15%时,产生蛋白的量达到最大值,当接种量再增加,蛋白的含量随之减少,这主要是由于接种量在适当范围时,产朊假丝酵母正常发酵代谢产生蛋白,当接种量超过一定范围时,酵母代谢旺盛,使发酵液升温过高,这对产朊假丝酵母的生长繁殖是不利的,会抑制产朊假丝酵母的生长繁殖代谢。因此,本实验最终选择产朊假丝酵母的接种量为10%～15%。

2.5.2 产朊假丝酵母发酵条件的优化实验

产朊假丝酵母的发酵结果受反应固液比、反应温度、pH值、反应时间4个因素的影响,采用一组四因素三水平正交试验对发酵工艺条件进行优化。试验方案和试验结果如表4和表5所示。

表4 正交试验因素与水平Tab.4 Factors and levels of Orthogonal experiment

表5 正交试验结果Tab.5 Results of Orthogonal experiment

由表4和表5可以看出,产朊假丝酵母发酵反应最优条件为A2B2C3D1,即反应固液比为1∶3,反应温度为30 ℃,pH值为5.5,反应时间为48 h;各因素对发酵反应的影响由大至小依次为发酵反应温度、pH值、反应时间、反应固液比。

3 产品质量标准[14]

3.1 感官指标

色泽:淡黄色。

状态:成粉末状,无结块现象。

滋味与气味:具有产品特有的滋味和气味,无其他异味。

杂质:无正常视力可见的外来杂质。

3.2 理化指标

蛋白质≥55.0%,钙≥750 mg/kg,磷≥12.0%,铁≥48.0 mg/kg,锌≥259 mg/kg。

3.3 微生物指标[15]

菌落总数≤10cfu/g,大肠菌群<30MPN/100g,酵母菌<10cfu/g,致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)未检出。

4 结 论

通过单因素实验、正交试验和方差分析的方法对玉米秸秆发酵生产新型蛋白产品—单细胞蛋白的工艺进行了研究,确定了玉米秸秆最佳的预处理试剂为氨水;绿色木霉(13001)最佳的接种量为10%～15%;玉米秸秆发酵最佳氮素营养为氯化铵;产朊假丝酵母(1769)发酵反应最佳工艺条件为加入3倍体积水,调节初始pH值为5.5左右,在30 ℃条件下,发酵反应48 h。在上述工艺条件下制备的新型蛋白产品—单细胞蛋白中蛋白含量达到55%。

[ 1 ]阚建全. 食品化学[M]. 北京:中国农业大学出版社, 2002:146-147.

[ 2 ]刘国钧,王连成. 图书馆史研究[M]. 北京:高等教育出版社, 1979:15-18.

[ 3 ]郭雪山,肖玫. 单细胞蛋白的应用及其开发前景[J]. 中国食物与营养, 2006(5):23-24.

[ 4 ]梁新红. 微生物降解玉米秸秆生产单细胞蛋白的研究[D]. 杨凌:西北农林科技大学, 2003.

[ 5 ]刘起丽,张建新,葛文娇,等. 一株产纤维素酶真菌的筛选及其对秸秆的降解效果研究[J]. 现代食品科技, 2014(6):82-86.

[ 6 ]梁新红,常景玲. 作物秸杆生产单细胞蛋白的研究概况[J]. 山西食品工业, 2003(3):5-9.

[ 7 ]李立伟,聂麦茜. 微生物发酵木质纤维素类物质生产单细胞蛋白质的研究状况[J]. 山西能源与节能, 2007(1):29-30.

[ 8 ]王中风,曾凡坤,杨幼慧. 单细胞蛋白发展状况及作为食物的前景[J]. 四川食品与发酵, 1994,21(2):14-17.

[ 9 ]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会. 食品安全国家标准,食品中蛋白质的测定:GB 5009.5—2010[S]. 北京:中国标准出版社, 2010.

[10]张永华. 食品分析[M]. 北京:中国轻工业出版社, 2004.

[11]LECHNER B E,PAPINUTH V L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw[J]. Process Biochem, 2009,41:594-598.

[12]殷海成. 玉米芯发酵生产单细胞蛋白初步研究[J]. 饲料资源, 2011(5):41-42.

[13]刘晓晶,李田,翟增强. 纤维素酶的研究现状及应用前景[J]. 安徽农业科学, 2011(4):1920-1924.

[14]UGALDEN U,CASTRILLO J,KHACHATOURIANS,et al. Single Cell Proteins from Fungi and Yeasts[M]∥Agriculture and food production, Elsevier Science & Technology, 2002:123-150.

[15]中华人民共和国质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会. 饲料添加剂饲用活性干酵母(酿酒酵母):GB/T 22547—2008[S]. 北京:中国标准出版社, 2008.

[16]高玉荣,刘洋,李大鹏,等. 大豆糖蜜高产单细胞蛋白菌株的筛选及其生长条件[J]. 中国酿造, 2010(8):33-36.

Research on key techniques of production of single cell protein from maize straw

HE Huan1, LYU Mei1, ZHEN Guangtian1, ZHAO Lichun2

(1.Research Information Room, Shenyang Grain and Oil Food Science Research Institute, Shenyang 110025, China; 2. College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Using maize straw as main research objects, the hydrolysis of cellulose with excellent performance of Trichoderma viride(13001) and high-yield protein of Candida utilis yeast strains(1769) for fermentation production processing together,producting the single cell protein products of high protein content and rich in various mineral elements. Discussed the pretreatment methods of maize stalk, the inoculation technology of green wood mold, the cellulose degradation process, the effects of different nitrogen sources on the fermentation of maize straw and single cell protein fermentation process, by contrast experiments, the best pretreatment method of maize stalk was pretreated by adding ammonia, the highest efficiency of enzyme production was adding 6% trichoderma viride(13001), the hydrolysis of 24 h with the addition of 15% cellulase was the most complete, the best effect of the fermentation was added ammonium chloride as the nitrogen source were determined, by orthogonal test to determine the optimum fermentation technological conditions of single cell protein is added in 3 times of water,temperature controlled in 29～31 ℃,starting pH at about 5.5, fermentation for 48 hours.

maize straw; trichoderma viride; candida utilis; single cell protein

2016-01-15。

沈阳市科技局科学事业费科技专项项目(2008017)。

何 欢(1982-),女,河北青龙人,沈阳市粮油食品科学研究所高级工程师; 通信作者: 肇立春(1966-),女,辽宁丹东人,沈阳师范大学教授。

1673-5862(2016)03-0311-05

TS210.9

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.03.012