β-catenin/Akt信号通路在亚硒酸钠诱导的胃癌细胞凋亡中的机制研究

王海波，刘延军，陈树伟，武文龙，李凤臣

(解放军第107医院 胃肠科，山东 烟台 264002)

β-catenin/Akt信号通路在亚硒酸钠诱导的胃癌细胞凋亡中的机制研究

王海波Δ，刘延军，陈树伟，武文龙，李凤臣

(解放军第107医院 胃肠科，山东 烟台 264002)

目的 探讨β-catenin/Akt信号通路在亚硒酸钠诱导的胃癌细胞凋亡中的机制研究。方法 培养胃癌细胞株SGC-7901，0、5、10、20 μmol/L亚硒酸钠处理细胞，24 h后流式细胞仪检测细胞的凋亡率变化；10 μmol/L的亚硒酸钠处理细胞，24 h后流式细胞仪检测细胞周期变化；10 μmol/L的亚硒酸钠处理细胞，0、6、12、24 h后Western blot检测β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表达量及蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的活性。结果 5、10、20 μmol/L亚硒酸钠处理细胞的凋亡率显著高于0 μmol/L(P<0.01)。10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞24 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞显著减少，S期及G2/M期细胞显著增加(P<0.05)，G2/M期细胞增加(P<0.05)；10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12和24 h的蛋白表达量显著低于0h(P<0.01)，且随着时间的延长，蛋白的表达量逐渐减少；10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，p-Akt在6、12和24 h的含量显著低于0 h(P<0.01)，而Akt各时间点比较差异无统计学意义。结论 亚硒酸钠能诱导胃癌细胞的凋亡，阻滞细胞于S期，其作用机制可能与β-catenin/Akt信号通路有关。

亚硒酸钠；β-catenin/Akt；胃癌；凋亡

癌症是机体内细胞的恶性增殖形成的恶性肿瘤。随着人们生活方式以及环境的改变，癌症的发病率呈逐年上升的趋势，给人们的健康造成了严重的威胁。虽然随着医疗技术的发展，癌症的早期诊断和治疗有一定的突破，但癌症的发病仍然很高[1-3]。硒是人体必需的一种微量元素，研究显示，硒不仅能预防肿瘤的发生，而且能有效治疗肿瘤，主要机制是引发肿瘤细胞的凋亡[4-5]。亚硒酸钠是最早研究的一种无机硒，许多研究已经证实亚硒酸钠能促进肝癌、骨肉瘤、直肠癌等细胞的凋亡，但亚硒酸钠与胃癌细胞的作用机制的研究比较少[6-8]。β-catenin对促进细胞凋亡和维持细胞生存发挥重要作用[9]，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)能对肿瘤细胞的活性进行调控[10]，因此，本研究对β-catenin/Akt信号通路在亚硒酸钠诱导的胃癌细胞凋亡中的机制研究，以期为后续的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：胃癌细胞株SGC-7901由山东大学细胞生物研究中心提供。

1.1.2 试剂：β-catenin、Akt、cyclin D1、survivin单克隆抗体均购自美国Abcaminc；DMEM培养基购自美国Gibco；亚硒酸钠、胰蛋白酶均购自美国Sigma；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国BD；碘化丙啶购自Sigma-Aldrich；RNA酶购自Invitrogen。

1.1.3 仪器：CK2-TRC-3型倒置荧光显微镜购自日本Olympus；BB5060UV型细胞培养箱购自德国Heraeus；LSR II流式细胞仪购自美国BD；DYCZ-24EN垂直电泳槽购自北京六一仪器。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:从液氮罐中取出装有胃癌细胞株SGC-7901的冻存管，放入事先调好温度的37 ℃水浴锅中解冻，并轻轻摇动冷冻管使其在1 min内全部融化，加入含有10% FBS的DMEM细胞生长液的离心管中，1000 r/min离心8 min，弃上清，加入细胞生长液悬浮细胞，接种于细胞96孔培养板中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h，更换培养基。细胞融合度达到90%时，倒掉细胞培养液，PBS洗涤细胞2次，加入1 mL胰酶消化细胞，细胞呈单个存在时，终止消化，1000 r/min离心8 min，除去酶消化液，PBS重悬细胞，离心后加入细胞生长液，将细胞种植于培养板中，37 ℃，5%CO2浓度培养箱中培养。

1.2.2 细胞的转染：取对数生长期的胃癌细胞株SGC-7901，0.25 %的胰酶消化细胞，观察到细胞呈单个存在时，转移到一个新的离心管中，1000 r/min离心7 min，弃上清，加入不含有胎牛血清的不完全培养液接种到细胞培养板中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养1 h。0、5、10、20 μmol/L亚硒酸钠与不完全培养基混合后加入到胃癌细胞株SGC-7901中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养6 h后，更换为含有胎牛血清的完全培养基继续培养。

1.2.3 流式仪检测细胞凋亡：取加入0、5、10、20 μmol/L亚硒酸钠处理的胃癌细胞株SGC-7901，培养24 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞为单个细胞，加入PBS重悬细胞，并调整细胞浓度为2×106个/mL，取1 mL细胞悬液至离心管中，1000 r/min，4 ℃离心8 min，弃去上清，PBS洗涤细胞2次，在沉淀中加入200 μL Binding Buffer，混合均匀后分别加入5 μL PI和 Annexin-V，避光室温静置20 min ，加400 μL缓冲液，流式细胞仪观察细胞凋亡情况。共检测3次。

1.2.4 细胞周期检测：取对数生长期的胃癌细胞5×104个/mL培养24 h后，加入10 μmol/L的亚硒酸钠共培养24 h，同时设置对照组(无亚硒酸钠)。收集细胞，PBS洗涤细胞，4 ℃乙醇固定12 h后，离心除去乙醇，加入1% 200 μL RNA酶溶液，37 ℃、15 min水浴，加入碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞周期。共检测3次。

1.2.5 Western blot检测β-catenin、cyclin D1、survivin的表达及Akt蛋白的活性：10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞0、6、12、24 h后，收集细胞，弃上清，PBS洗涤细胞3次，胰酶消化细胞，1000 r/min，离心8 min，PBS悬浮细胞。按照试剂盒步骤提取细胞蛋白和测定提取的蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液充分混合，100 ℃变性5 min。每孔加入50 μL样品，调整电泳时电压。电泳结束后，取出蛋白凝胶，将滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸依次夹好，4 ℃转膜过夜。取出PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭后，分别以β-catenin、cyclin D1、survivin、Akt作为一抗(1:500)，4℃孵育过夜，TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1000)，37 ℃孵育1h，TBST清洗后加入ECL发光剂显影，以β-actin为内参用自动凝胶成像系统采集图像并计算蛋白表达率。

2 结果

2.1 不同浓度亚硒酸钠对细胞凋亡率的影响 0、5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞24 h后，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠处理的细胞的凋亡率(12.46±1.08、21.79±1.42、14.34±1.16)显著高于 0 μmol/L(3.12±0.78)(P<0.01)，其中10 μmol/L亚硒酸钠处理的细胞凋亡率高于5 μmol/L和20 μmol/L(P<0.01)，因此选择10 μmol/L做后续研究。见图1。

图1 不同浓度的亚硒酸钠处理对胃癌细胞凋亡率的影响A：流式细胞结果；B：细胞凋亡率**P<0.01，与0 μmol/L比较Fig.1 Effect of sodium selenite at different concentrations on apoptosis rate (n=3，±s)A：flow cytometry；B: apoptosis rate**P<0.01，compared with 0 μmol/L

2.2 细胞周期检测 10 μmol/L亚硒酸钠作用于胃癌细胞24 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞减少，S期及G2/M期细胞增加(P<0.05，P<0.01)，说明细胞发生S期阻滞，细胞增殖受到抑制。见表1。

表1 亚硒酸钠处理对细胞周期的影响Tab.1 Effect of sodium selenite on cell cycle (n=3，±s，%)

*P<0.05，**P<0.01，与0 μmol/L比较，compared with 0 μmol/L

2.3 Western blot检测不同时间点β-catenin、cyclin D1和survivin检测 10 μmol/L亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12、24 h的蛋白表达量显著低于0 h(P<0.01)，且随着时间延长，蛋白的表达量逐渐减少，说明亚硒酸钠处理能抑制细胞蛋白的表达。见图2、表2。

图2 Western blot检测亚硒酸钠作用于胃癌细胞后相关蛋白表达量Fig.2 Related protein expression treated by sodium selenite detected by Western blot

组别蛋白表达率β⁃catenincyclinD1survivin0h0628±00150506±00110602±0014 6h0439±0012∗∗0377±0012∗∗0413±0013∗∗12h0189±0007∗∗0142±0007∗∗0164±0009∗∗24h0102±0004∗∗0007±0002∗∗0099±0003∗∗

**P<0.01，与0 μmol/L比较，compared with 0 μmol/L

2.4 Western blot检测Akt活性 10 μmol/L亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，Akt在0、6、12、24 h比较差异无统计学意义，p-Akt在6、12、24 h的蛋白表达量显著低于0h(P<0.01)，说明亚硒酸钠能抑制Akt的激活。见图3、表3。

图3 Western blot检测亚硒酸钠处理细胞p-Akt及Akt蛋白变化情况Fig.3 p-Akt and Akt expression treated by sodium selenite detected by Western blot

组别蛋白表达量Aktp⁃Akt0h122±00110421±00076h120±00120302±0008∗∗12h119±00100199±0007∗∗24h121±00090105±0006∗∗

**P<0.01，与0 μmol/L比较，compared with 0 μmol/L

3 讨论

硒是生物体必须的一种微量元素，主要以硒化合物的形式存在，研究显示，硒对人类的健康发挥重要的作用，能延缓衰老、抗肿瘤等作用，已受到广大研究者的关注[11-12]。胃癌是一种消化道恶性肿瘤，其发生发展不仅与细胞的恶性增殖和异常分化有关，而且与肿瘤细胞的凋亡也有很大的关系[13-14]。因此，研究硒对肿瘤细胞的影响机制具有重要意义。

硒化合物能够通过诱导细胞凋亡和增加细胞毒性从而对肿瘤细胞造成影响[15]。当高浓度的硒化合物作用于肿瘤细胞时，能引起细胞直接的毒性作用，使细胞的结构造成损伤，导致细胞膜崩解，从而达到杀死癌细胞的目的[16-17]。研究显示，亚硒酸钠能诱导胃癌细胞凋亡，作用机制与细胞周期有关[18]。本研究中，流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果发现5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠处理的细胞的凋亡率显著高于 0 μmol/L(P<0.01)。进一步研究亚硒酸钠对细胞周期的影响，发现10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞24 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞减少，S期细胞增加(P<0.01)，其原因可能是亚硒酸钠使细胞发生S期阻滞，进而使细胞增殖受到抑制有关。

β-catenin是Wnt中的一员，在细胞通讯中占有重要作用，参与肿瘤的发生以及转移[19]。当细胞中无Wnt信号时，β-catenin被糖原合成激酶-3(Glycogen Synthase Kinase3,GSK-3)磷酸化，与结肠腺瘤样息肉蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)等蛋白结合而被降解。当Wnt与β-catenin受体结合后，能抑制GSK3，β-catenin不能被降解，在胞质中不断积累，积累过多时，就会转入核内，与淋系增强子结合因子1(lymphoid enhancer factor，LEF1)和转录因子-4(transcription factor 4 ,TCF4)结合，对cyclin D1、survivin等靶基因进行调控，从而参与细胞的活动，调控多种疾病的发生[20-21]。本研究用10 μmol/L的亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，结果显示，β-catenin、cyclin D1和survivin在6、12 h和24 h的蛋白表达量显著低于0h(P<0.01)，且随着时间的延长，蛋白的表达量逐渐减少，说明亚硒酸钠处理能抑制细胞蛋白的表达。

Akt在多种肿瘤细胞中表达量很高，是细胞内重要的促进存活因子[22]。研究表明，Akt能使β-catenin发生磷酸化，促进β-catenin的入核和转录[23]。因此，本研究用10 μmol/L亚硒酸钠作用于胃癌细胞后，结果显示亚硒酸钠能降低Akt的磷酸化(P<0.01)，说明亚硒酸钠能抑制Akt的激活。

综上所述，亚硒酸钠能诱导胃癌细胞的凋亡，阻滞细胞于S期，其作用机制可能与β-catenin/Akt信号通路相关。

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(编校：王俨俨)

Mechanism of β-catenin/Akt signaling pathway in apoptosis of gastric cancer cells induced by selenite sodium

WANG Hai-boΔ, LIU Yan-jun, CHEN Shu-wei, WU Wen-long, LI Feng-chen

(Department of Gastroenterology, PLA 107th hospital, Yantai 264000, China)

ObjectiveTo explore the mechanism of β-catenin/Akt signaling pathway in the apoptosis of gastric cancer cells induced by selenite sodium.MethodsGastric cancer cell line SGC-7901 was cultured, and 0 mol/L, 5 mol/L, 10 mol/L and 20 mol/L selenite sodium treated cells; flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate after 24 h; 10 mol/L sodium selenite treated cells, flow cytometry was used to detect the cell cycle changes after 24 h; 10 mol/L sodium selenite treated cells,protein expression of β- catenin,cyclin D1 and protein kinase B (Akt) activity were detected by Western blot after 0,6,12,24 h.ResultsCells apoptosis rate was significantly higher than 0 mol/L after cells was treated by 5 mol/L, 10 mol/L and 20 mol/L sodium selenite, due to cells apoptosis rate was higher by 10 mol/L sodium selenite treated than 5 mol/L and 20 mol/L, 10 mol/L sodium selenite treated cells for follow-up study; gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite for 24 h, compared with the control group, G0/G1 phase cells decreased, cells in S phase and G2/M phase significantly increased(P<0.05);gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite for 0 h, 6 h, 12 h and 24 h,protein expression of β-catenin and cyclin D1 and Survivin in 6 h, 12 h and 24 h was significantly lower than that in 0 hour(P<0.01),and with the extension of time, protein expression gradually decreased; gastric cancer cells was treated by 10 mol/L sodium selenite could significantly decrease the phosphorylation of p-Akt in 6,12,24 h, while there was no significant difference of Akt among difference time points(P<0.01).ConclusionSodium selenite could induce apoptosis of gastric cancer cells, and the cells were arrested in S phase. The mechanism may be associated with beta-catenin/Akt signaling pathway.

sodium selenite;β-catenin/Akt; gastric cancer; apoptosis

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2009SW010)

王海波，通信作者，男，硕士，副主任医师，研究方向：胃癌，E-mail：wang13145356111@163.com。

R735.2

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