木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响

孙乃坤，王耀宗，刘志刚，付代杰，尚希福，李旭

(1.厦门大学附属第一医院 骨科，福建 厦门 361003；2.厦门大学附属中山医院 骨科，福建 厦门 361003；3.吉林大学附属第二医院 骨科，吉林 长春 130041；4.安徽医科大学附属省立医院 骨二科，安徽 合肥 230001)

木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响

孙乃坤1Δ，王耀宗2，刘志刚3，付代杰4，尚希福4，李旭4

(1.厦门大学附属第一医院 骨科，福建 厦门 361003；2.厦门大学附属中山医院 骨科，福建 厦门 361003；3.吉林大学附属第二医院 骨科，吉林 长春 130041；4.安徽医科大学附属省立医院 骨二科，安徽 合肥 230001)

目的 研究木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响。方法 用免疫磁珠分选法分离人骨肉瘤细胞株MG-63中的CD133+骨肉瘤干细胞。MTT法检测0、0.01、0.02、0.04 mg/mL木犀草素溶液对骨肉瘤干细胞增殖的影响。Western blot检测木犀草素对骨肉瘤干细胞Ki67蛋白以及对骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路的影响。结果 用免疫磁珠分选法，得到比率为(87.60±5.06)%的骨肉瘤干细胞。通过MTT实验发现，与对照组比较，0.01、0.02、0.04 mg/mL木犀草素能够抑制骨肉瘤干细胞的增殖(P<0.05)。Western blot实验表明，与对照组比较，木犀草素各浓度抑制骨肉瘤干细胞Ki67蛋白的表达(P<0.05)。与对照组比较，木犀草素各浓度组对骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达具有抑制作用(P<0.05)。结论 木犀草素对骨肉瘤干细胞具有抑制作用。

木犀草素；骨肉瘤干细胞；增殖；Ki67；JAK2/STAT3信号通路

骨肉瘤是临床相对常见的恶性肿瘤，多发于少儿或青少年，该病预后不良，相当多的患者因该病而死亡[1]。近几年来，随着保肢手术的不断发展以及全新化疗药物的研制成功，骨肉瘤的疗效有了较大的提高。但是，转移以及复发的骨肉瘤患者预后差，并且继发转移以及耐化疗药物骨肉瘤的出现仍然是严重的问题[2]。

木犀草素是来源于植物的一种黄酮类物质，木犀草素能够抑制骨肉瘤细胞的生长增殖，干扰骨肉瘤细胞新陈代谢从而诱导其凋亡，对于骨肉瘤的治疗具有较高的应用价值[3]。骨肉瘤细胞株中存在肿瘤干细胞[4]。但是木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响未见报道。现有的治疗手段并没有将肿瘤干细胞完全杀灭，只要有肿瘤干细胞的存在,骨肉瘤就可以继续自我更新和不断增殖分化重新形成肿瘤,导致复发和转移[5]。因此研究新的针对肿瘤干细胞的药物有很重要的现实意义[6]。

本研究旨在从MG63中分离骨肉瘤干细胞，并且探讨木犀草素对骨肉瘤干细胞的抑制效应及其机制，为临床治疗骨肉瘤提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：MG63骨肉瘤细胞系购自厦门大学。

1.1.2 试剂：DMEM高糖细胞培养液、0.02% EDTA+0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，木犀草素、二甲基亚砜(DMSO)、MTT噻唑蓝(美国Sigma公司)，人CD133+细胞分选试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司)，GAPDH(上海康成生物工程有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒、Ki67单克隆抗体、小鼠抗兔二抗(美国Cell Signaling Tec公司)。

1.1.3仪器：恒温培养箱(美国Thermo公司)，多功能酶标仪(德国Miltenyi BioTec公司)，流式细胞分选仪BD FACSAria II、流式细胞仪ACSCalibur(美国Becton Dickinson公司)

1.2 方法

1.2.1 骨肉瘤细胞系的培养：将MG63骨肉瘤细胞(1×106/mL)培养在25 cm2培养瓶里的DMEM-高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。每2～3 d换液一次，每3～4 d传代一次。用混合消化液(0.02% EDTA+0.25%胰蛋白酶)进行消化，然后收集细胞离心1 000 r/min，5 min，传代培养。

1.2.2 CD133+骨肉瘤干细胞分选：将培养瓶中的MG63骨肉瘤细胞进行消化离心，重悬浮后，按CD133免疫磁珠分选试剂盒说明书操作，计数1×108个细胞，用300 μL分选缓冲液重悬，加入FcR阻断试剂和CD133磁珠试剂各100 μL，4 ℃温育30 min后清洗，MACS磁性分选柱分离出CD133+细胞，继续常规培养，分选后取用传4～6代的细胞用于实验。应用流式细胞仪分析测定CD133+干细胞的纯度。

1.2.3 细胞分组及培养：将CD133+细胞以每孔1×103个细胞接种于96孔培养板，设6个复孔。待细胞细胞贴壁后每孔加入木犀草素，使终浓度依次为0、0.01、0.02、0.04 mg/mL。置于常规条件培养24 h。

1.2.4 MTT法检测木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响：按1.2.3中方法培养细胞，分别向每孔加入滤过的5 mg/mL MTT工作液继续培养5 h后终止培养。弃去96孔板原有液体，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解后在λ=490 nm处检测各孔吸光度(A值)。

1.2.5 Western blot检测木犀草素对骨肉瘤干细胞Ki67蛋白及JAK2/STAT3信号通路的影响：按1.2.3中方法培养细胞，将细胞用冷的PBS洗2次，使用RIPA裂解液(添加蛋白酶抑制剂cocktail)裂解细胞，4℃，12000g离心5 min，取上清，BCA法定量细胞总蛋白浓度，每组样品取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，100 V转膜1 h。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入鼠抗Ki67、兔抗JAK2、兔抗STAT3、兔抗p-JAK2、兔抗p-STAT3及GAPDH的抗体作为一抗，以GAPDH作为内参，37 ℃孵育2 h。HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠作为二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL显色液，胶片曝光检测蛋白表达，使用IPP6.0灰度扫描软件分析蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 免疫磁珠分选后CD133+骨肉瘤干细胞比例 利用免疫磁珠分选技术,从MG63普通骨肉瘤细胞中分选CD133+的骨肉瘤细胞，分选后的CD133+阳性比例从(1.12±0.03)%上升到(87.6±5.06)%(P<0.001)，见图1。

图1 CD133+骨肉瘤干细胞分选前后所占的细胞比例***P<0.001，与分选前相比Fig.1 Proportion of CD133+ osteosarcoma stem cells pre- and ***P<0.001，compared with pre-separation

2.2 木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响 MTT结果显示,木犀草素各浓度组与对照组吸光度差异有统计学意义(F=52.76，P<0.05)。加木犀草素的CD133+骨肉瘤干细胞的增殖率[0.01 mg/mL(71.81±5.31)%、0.02 mg/mL(51.06±4.72)%、0.04 mg/mL(36.09±2.82)%]明显低于对照组(89.65±6.04)%，经进一步两两比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，随着木犀草素浓度的增大，骨肉瘤干细胞的增殖率逐渐减小。见图2。

图2 MTT法检测不同浓度木犀草素对CD133+骨肉瘤干细胞增殖的影响*P<0.05，与对照组相比Fig.2 Effect of luteolin at different concentrations on the proliferation of CD133+ sosteosarcoma stem cells by MTT(n=5，±s)*P<0.05，compared with control group

2.3 木犀草素对骨肉瘤干细胞Ki67蛋白表达的影响 木犀草素各浓度组与对照组Ki67蛋白表达差异有统计学意义(F=46.67，P<0.05)。加木犀草素的CD133+骨肉瘤干细胞的Ki67蛋白表达[0.01 mg/mL(0.87±0.09)、0.02 mg/mL(0.62±0.08)、0.04 mg/mL(0.42±0.03)]明显低于对照组(1.00±0.11)(n=3)，经进一步两两比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，随着木犀草素浓度的增大，骨肉瘤干细胞Ki67蛋白表达明显受抑制。见图3。

图3 木犀草素对CD133+骨肉瘤干细胞Ki67蛋白表达的影响Fig.3 Effect of luteolin at different concentrations on Ki67 expression in CD133+ osteosarcoma stem cells

2.4 木犀草素对骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路的影响 木犀草素各浓度组与对照组磷酸化JAK2蛋白(F=67.03)和磷酸化STAT3蛋白(F=81.72)表达差异有统计学意义(P<0.05)，表明木犀草素能抑制骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路。结果显示，随着木犀草素浓度的增加，JAK2/STAT3信号通路明显受抑制。见图4、表1。

图4 木犀草素对CD133+骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路的影响Fig.4 Effect of luteolin at different concentrations on JAK2/STAT3 signal pathway in CD133+ osteosarcoma stem cells

木犀草素浓度(mg/mL)JAK2p⁃JAK2STAT3p⁃STAT30100±009100±010100±008100±008001098±009071±006099±010068±006002106±012050±007102±009055±007004097±008032±005107±011028±005

3 讨论

骨肉瘤主要来源于间叶细胞，是由具有极强恶性增殖能力的肉瘤细胞产生的不成熟骨组织或者骨肿瘤性组织，是最常见的原发骨肿瘤，好发于青少年[2,7-9]。转移对骨肉瘤的预后有重要影响，多项研究表明[10-12]在骨肉瘤转移进程中，肿瘤的转移及侵袭与肿瘤干细胞密切相关。肿瘤干细胞的存在是肿瘤进展、转移、复发和耐药的根源[13-14]。目前肿瘤治疗失败的原因，很可能就是没有针对肿瘤干细胞的有效药物[15]。因此对骨肉瘤干细胞进行分离，并且研究新的针对肿瘤干细胞的药物有很重要的现实意义。

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中[16]。最初是从木犀草科分离出而得名，可从多种天然药材、蔬菜果实中分离得到。木犀草素具有丰富的药理及生物学活性，如消炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，有着广阔的应用前景[17-20]。近年来，木犀草素的抗癌活性引起人们的关注。木犀草素对多种肿瘤细胞的增殖具有不同程度的抑制作用，如肝癌、前列腺癌、胃癌、食管癌等，机制包括抑制肿瘤细胞增殖，停止细胞生长周期，促进细胞凋亡，抑制血管生成，抑制DNA拓扑异构酶，抗氧化、抗突变等[21-24]。蔡良真[25]采用台盼蓝拒染法检测木犀草素对HL-60细胞体外增殖，发现木犀草素能显著地抑制HL-60细胞增殖，并呈时间-剂量效应。王旭光等[26]发现，木犀草素在诱导K562细胞凋亡过程中存在Caspase-3的活化，提示木犀草素可能通过激活Caspase-3诱导K562细胞凋亡。同时，Chen等[27]发现木犀草素能通过抑制IGF-1而使前列腺癌PC-3和DU145细胞中IGF-1R、AKT活化,AKT的抑制可使其下游蛋白p70S6K1，GSK-3beta和FKHR/FKHRL1的磷酸化。木犀草素也能抑制IGF-1诱导的EGFR和MAPK/ERK途径的激活，抑制cyclinD1的表达，增加p21的表达，从而抑制了前列腺癌细胞的增殖[27-29]。

王永宏等[30]研究表明，木犀草素对骨肉瘤细胞也有很强的抑制效应，研究发现木犀草素对于骨肉瘤细胞MG63的生长、增殖、运动迁移能力、穿膜细胞数量以及IL-6蛋白表达水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用随着木犀草素浓度的增加而逐渐增强，说明木犀草素对于骨肉瘤细胞具有极强的抑制作用，但其作用机制仍不清楚。木犀草素对骨肉瘤干细胞的研究也未见报道。

在本研究中，采用免疫磁珠分选法从MG63骨肉瘤细胞中分离出纯度较高CD133+骨肉瘤干细胞。经木犀草素处理后，骨肉瘤干细胞的增殖受到抑制，明显不如未经木犀草素处理及低浓度木犀草素处理的骨肉瘤干细胞生长状况(P<0.05)，初步证实木犀草素能够抑制骨肉瘤干细胞的生长增殖。为进一步探明木犀草素可能对骨肉瘤干细胞增殖存在的抑制效应，本研究还从分子水平上分析了木犀草素对增殖标志物Ki67和增殖相关信号通路JAK2/STAT3通路的影响。本研究结果显示，木犀草素处理可显著降低Ki67表达及磷酸化JAK2蛋白和磷酸化STAT3蛋白的表达(P<0.05)。表明木犀草素能抑制骨肉瘤干细胞增殖及JAK2/STAT3信号通路。其中，JAK2/STAT3信号通路是一种与细胞增殖关系密切的信号通路，而且目前已证实其高表达和异常可促进肿瘤的发生和发展，并与多种恶性肿瘤患者愈后差呈正相关[31-33]。刘艳武等[34]证实抑制JAK2/STAT3信号通路能够抑制人骨肉瘤细胞的活性。JAK/STAT通路对体内多种信号的转导都非常的关键[35-37]。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2，这4个蛋白结构及功能相似。JAK的活化在细胞增殖、分化、迁移及凋亡中均有重要的作用[38-39]。结构活化的JAKs会使细胞内许多重要的物质磷酸化，其中包括STAT家族，STAT家族中的STAT3与许多肿瘤的信号通路相关[40-41]。结构活化后的STAT3和人实体肿瘤细胞的存活与生长关系密切[42]。STAT3还可上调人肿瘤细胞抗凋亡基因编码的Mcl-1、Bcl-xL蛋白[43-44]。磷酸化的STAT3是一种肿瘤快速生长的标志。更为重要的是活化的JAK2/STAT3信号作为治疗实体肿瘤一个重要的目标分子已经被广泛地确认其有效性[31,45-47]。

综上所述，使用木犀草素处理的骨肉瘤干细胞其增殖能力显著降低，并且与细胞增殖密切相关的Ki67蛋白表达和JAK2/STAT3信号通路均受到抑制，并且其抑制程度随着木犀草素浓度的升高而增强。

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(编校：王俨俨)

2016中国生化药物前沿-精准医学·创新药物学术论坛暨《中国生化药物杂志》编委会年会会议通知

由中国药学会生化与生物技术药物专业委员会、北京大学药学院、浙江大学药学院、分子肿瘤学国家重点实验室、天然药物及仿生药物国家重点实验室、医视界共同主办，《中国生化药物杂志》和北京数字时代科技有限公司共同承办的“2016中国生化药物前沿-精准医学·创新药物学术论坛暨《中国生化药物杂志》编委会年会”将于2016年12月8日-10日在北京召开。

一、大会组织

主办单位：

中国药学会生化与生物技术药物专业委员会

北京大学药学院

浙江大学药学院

分子肿瘤学国家重点实验室

天然药物及仿生药物国家重点实验室

医视界

承办单位：

《中国生化药物杂志》

北京数字时代科技有限公司

大会主席：詹启敏

二、大会网站：2016fafbp.cbcpharm.com

三、联系方式

学术联系人：吴 茜 010-84280076-8720；13581939531

学术邮箱：wuxi@cyberzone.cn

会务邮箱：tianxiaojuan@cyberzone.cn

DOI：10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.007

Effects of luteolin on proliferation of osteosarcoma stem cells

SUN Nai-kun1Δ, WANG Yao-zong2, LIU Zhi-gang3, FU Dai-jie4, SHANG Xi-fu4, LI Xu4

(1.Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China; 2.Department of Orthopaedics, Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen 361003, China; 3.Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, China; 4.Department of Orthopaedics, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China)

ObjectiveTo explore the effect of luteolin on the proliferation of osteosarcoma stem cells.MethodsCD133+osteosarcoma stem cells were separated from MG63 cells by flow cytometer.MTT was used to investigate the effects of luteolin(0,0.01,0.02,0.04 mg/mL)on the proliferation of osteosarcoma stem cells.Western blot was used to detect the levels of Ki67 protein and components of JAK2/STAT3 signal pathway in osteosarcoma stem cells induced.ResultsAfter sorting,the content of the CD133+fraction was enriched up to(87.60±5.06)%.MTT assay showed that,compared with the control group,luteolin(0.01,0.02,0.04 mg/mL)inhibited proliferation of CD133+osteosarcoma stem cells(P<0.05).Western blot also showed that luteolin significantly decreased the level of Ki67 compared with the control group(P<0.05).In addition,the luteolin inhibited the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in JAK2/STAT3 signal pathway of CD133+osteosarcoma stem cells compared with the control group(P<0.05).ConclusionLuteolin might be a suppressor of osteosarcoma stem cells.

luteolin;osteosarcoma stem cells;proliferation;Ki67;JAK2/STAT3 signal pathway

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.006

安徽省教育厅自然科学基金(KJ2001Z204)

孙乃坤，通信作者，男，硕士，主治医师，研究方向：骨科疾病，E-mail：sunnaikunsnk@163.com。

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