地塞米松对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬细胞分化的影响

黄茜，汪理，李晓南

(1.湖北省体育科学研究所，湖北 武汉 430205；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北 武汉 430022；3.华中科技大学医院 呼吸内科，湖北 武汉 430074)

地塞米松对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺泡巨噬细胞分化的影响

黄茜1，汪理2，李晓南3Δ

(1.湖北省体育科学研究所，湖北 武汉 430205；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北 武汉 430022；3.华中科技大学医院 呼吸内科，湖北 武汉 430074)

目的 观察地塞米松(dexamethasone,DEX)对小鼠骨髓来源的巨噬细胞(respiratory syncytial virus,BMDM)及呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠的肺泡巨噬细胞分化的影响。方法 体外诱导培养M1型BMDM，鉴定其表型，观察DEX对巨噬细胞转录因子和细胞因子表达的影响；以RSV感染小鼠，同时给予DEX，观察DEX对小鼠肺泡巨噬细胞转录因子和细胞因子表达的影响。结果 DEX能抑制M1型BMDM及RSV感染小鼠的肺泡巨噬细胞中IL-6、IL-12、iNOS和IRF5的表达，并促进IL-10、Arginase-1和IRF4的表达，使M1型巨噬细胞向M2型转化。结论 DEX可在体内外将M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，抑制炎症反应，这可能是DEX治疗RSV感染的作用机制之一。

地塞米松；呼吸道合胞病毒；巨噬细胞

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)为副黏病毒科肺炎病毒属有包膜非节段性的单负链RNA病毒，是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要和常见的病毒病原体，可引起急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症，并能导致婴幼儿哮喘的发生[1]。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，可递呈抗原启动免疫应答，还可分泌多种炎症因子，参与免疫调节。根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞可分为M1型即经典活化的巨噬细胞和M2型巨噬细胞即替代活化的巨噬细胞[2]。 M1型巨噬细胞分泌促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α及iNOS等[3]，高表达IRF5、IRF8等转录因子[4-5]，具有较强的抗原提呈能力，参与正向免疫应答；M2型巨噬细胞可表达精氨酸酶1(Arginase-1)、巨噬细胞甘露糖受体(CD206)等[6-7]，高表达IRF4等转录因子[8]，抗原提呈能力较弱，还可分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等下调免疫应答，促进组织修复和抗炎症[9]。

肺脏是RSV感染时的主要受累器官，而肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)是引起肺部炎症反应的主要效应细胞。研究表明，RSV感染可激活AM，释放多种炎性介质和细胞因子如IL-12、IL-6、TNF-a等[10-11]，促使白细胞粘附和支气管痉挛；活化的巨噬细胞还能释放氧自由基，加重气道损伤[12]。

糖皮质激素可抑制免疫反应，减轻气道炎症反应，而地塞米松(dexamethasone，DEX)是临床上最为常用的糖皮质激素类免疫抑制剂之一。临床工作中DEX已被应用于RSV感染后的毛细支气管炎，但其作用机制尚不明确。巨噬细胞是DEX作用的主要效应细胞，本研究通过观察地塞米松对小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)及呼吸道合胞病毒感染小鼠的肺泡巨噬细胞分化的影响，探讨地塞米松用于RSV感染治疗的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及病毒株：50只雌性SPF级BALB/C小鼠购自湖北省疫病预防与控制中心(实验动物质量合格证编号No.42000600011887)；呼吸道合胞病毒A2株购自中国预防医学科学院病毒研究所。

1.1.2 主要实验试剂：Trizol 购自Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒和SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司；兔抗小鼠IRF4和IRF5多克隆抗体购自San Cruz 公司。ECL显色试剂盒购自Pierce公司。

1.1.3 主要实验仪器：流式细胞仪(Accuri C6，美国BD)；定量PCR仪(StepOne Plus，美国ABI)；化学发光检测系统(ES3 Imaging System，美国UVP)。

1.2 方法

1.2.1 M1型小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的诱导及DEX刺激：处死小鼠，用新洁尔灭浸泡5 min消毒，无菌剥取胫骨和股骨，剪去骨两端，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，用200目无菌尼龙网过滤得到骨髓细胞，加入红细胞裂解液4 mL裂解红细胞，PBS洗涤2次，将得到的骨髓细胞用含10%FBS的DMEM制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，加入10 cm2的培养皿中，加入粒单核细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，使其终浓度为50 ng/mL，37 ℃含5%CO2培养箱中培养7 d，第4天更换一次含GM-CSF的培养液。将收获的巨噬细胞调整细胞浓度至1×106/mL，加入6孔板中，同时加入地塞米松(10-8mol/mL)处理8 h，收获细胞备用。

1.2.2 M1型BMDM表型的鉴定：收集培养的M1型巨噬细胞，PBS洗2次，调整细胞浓度至1×106/mL，分别加入APC-F4/80、FITC-MHC-II及同型对照抗体，4 ℃孵育30 min，PBS洗2次，流式细胞仪检测F4/80和MHC-II的表达。

1.2.3 小鼠呼吸道合胞病毒感染模型建立[13]：戊巴比妥钠0.06 mg/g腹腔注射麻醉小鼠，伸直其颈部，小鼠鼻内滴入106PFU病毒液100 μL，DEX组小鼠在RSV感染第3天腹腔注射DEX 0.2 mg/kg，感染第7天处死小鼠，无菌取小鼠肺泡巨噬细胞用于后续实验。

1.2.4 小鼠肺泡巨噬细胞的纯化：处死小鼠，用新洁尔灭浸泡5 min消毒，沿正中线剪开颈部皮肤，分离气管，进行支气管肺泡灌洗，将得到的灌洗液300 g/min离心5 min，弃上清。加入红细胞裂解液裂解红细胞，所得细胞用含10%FBS的DMEM制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/mL，加入6孔板培养过夜，换液清除未贴壁的悬浮细胞。

1.2.5 定量PCR检测小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)及肺泡巨噬细胞中细胞因子的表达：Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。PCR反应依据SYBR Green Supermix说明书进行。参考Genebank序列设计引物，引物序列如下：

IRF-4 上游：5’-CTGCAAGTGTTTGCTCACCA-3’,

下游：5’-GAGTGGTAACGTGTTCAGGT-3’ ；

IL-10 上游：5’-AGTGGAGCAGGTGAAGAGTG-3’，

下游：5’-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3’；

Arginase-1 上游：5’-CAGAAGAATGGAAGAGTCGA-3’，

下游：5’-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3’；

IL-6 上游：5’-TCCCCTCCAGGAGCCCAGCTA-3’，

下游：5’-CAGGGCTGAGATGCCGTCGAG-3’；

IL-12 P35 上游：5’-CAGAATCACAACCATCAGCAG-3’，

下游：5’-CACCCTGTTGATGGTCACGAC-3’；

iNOS 上游：5’-AATAGAGGAACATCTGGCCAGG-3’，

下游：5’-ATGGCCGACCTGATGTTGC-3’；

GAPDH 上游：5’-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3’，

下游：5’-GCCTGCTTCACCACCTTC-3’

1.2.6 Western blot检测BMDM及肺泡巨噬细胞中转录因子IRF4和IRF5的表达：细胞裂解液裂解细胞，经5%浓缩胶，12%分离胶进行SDS-PAGE电泳。将蛋白条带电转移至PVDF膜上，10%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入兔抗小鼠IRF-4或IRF-5抗体室温反应1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，室温反应1 h，TBST洗膜4次，每次15 min，用ECL底物液显色。

1.3 统计学方法 以上实验均重复3次，定量PCR结果由ABI step one PCR扩增仪收集，PCR结束后，进行熔解曲线分析，检测PCR反应的特异性。使用相对定量方法对扩增反应进行分析，根据扩增曲线得到的Ct值，以2-ΔΔCT进行组间相对分析，采用两组独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 M1型BMDM表型鉴定 小鼠骨髓细胞诱导分化的M1型巨噬细胞表达F4/80，且高表达MHC-II类分子，证明在体外利用GM-CSF成功诱导得到M1巨噬细胞。

图1 M1型BMDM表型的鉴定Fig.1 Phenotype identification of M1 BMDM

2.2 DEX对BMDM表达IL-10、IL-12等炎症因子的影响 与对照组相比，加入DEX刺激M1型BMDM后，IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子明显上升，M2型巨噬细胞转录因子IRF4表达也明显升高，而IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明显降低。表明DEX能促进M1型BMDM表达IL-10等抑炎因子，抑制其表达IL-12等炎症因子。

图2 DEX对BMDM分泌细胞因子的影响*P<0.05Fig.2 Effects of DEX on cytokine secretion of M1 BMDM*P<0.05

2.3 DEX对BMDM表达转录因子IRF4和IRF5的影响 Western blot结果显示：与对照组相比，DEX能明显抑制BMDM中M1型巨噬细胞转录因子IRF5的表达，并能促进M2型巨噬细胞转录因子IRF4的表达，表明，DEX能促进BMDM由M1型向M2型转化。

图3 DEX对BMDM转录因子的影响*P<0.05Fig.3 Effects of DEX on transcriptional factors of M1 BMDM*P<0.05

2.4 DEX对RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞中IL-12、IL-10等抑炎因子表达的影响 结果显示：给RSV感染小鼠注射DEX能促进小鼠肺泡巨噬细胞中IL-10、Arginase-1等免疫抑制因子的表达，M2型巨噬细胞转录因子IRF4表达也明显升高，而注射DEX后肺泡巨噬细胞中内IL-12、IL-6、iNOS等促炎因子明显降低。表明DEX能抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞中IL-12等炎症因子的表达，促进IL-10等抑炎因子的表达。

图4 DEX对RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞分泌细胞因子的影响*P<0.05Fig.4 Effects of DEX on cytokine secretion of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

2.5 DEX对RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞中IRF4、IRF5表达的影响 Western blot 结果显示：与体外实验相似，DEX能明显抑制RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞中M1型巨噬细胞转录因子IRF5的表达，并能促进M2型巨噬细胞转录因子IRF4的表达。表明DEX也能在RSV感染小鼠体内促进巨噬细胞由M1型向M2型转化。

图5 DEX对RSV感染小鼠肺泡巨噬细胞转录因子的影响*P<0.05Fig.5 Effects of DEX on transcriptional factors of alveolar macrophages in RSV infection mice*P<0.05

3 讨论

RSV是婴幼儿下呼吸道感染的常见病因，婴幼儿急性RSV下呼吸道感染后常发生反应性气道疾病，在急性期过后可出现反复喘息症状，部分患儿可迁延发展为持续性哮喘。目前临床上对RSV感染以对症支持治疗为主，主要药物有糖皮质激素，支气管扩张剂等。DEX是一种长效糖皮质激素，在急性呼吸窘迫综合症、严重应激状态及慢性炎症性疾病(如类风湿关节炎和支气管哮喘)中，具有重要的应用价值。

肺泡巨噬细胞广泛分布于肺泡内及支气管表面，是肺组织接触抗原最早、机会最多的免疫细胞，组成肺部防御病原微生物和肺损伤的第一道防线[14]，在病原体入侵时，可释放大量细胞因子或炎性介质介导急性肺损伤。而巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，表现出明显的功能差异。根据巨噬细胞的表型，通常将其分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，不同极化表型的巨噬细胞在宿主抵抗病原微生物、肿瘤免疫、炎症反应和组织修复等过程中发挥着不同的功能和作用。M1型巨噬细胞表面表达MHC-II、CD11b、CD11c等分子，且高表达诱导性一氧化氮合酶(iNOS)，产生大量一氧化氮(NO)[15]，可杀灭病原微生物，人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)能上调转录因子IRF5的表达，促进巨噬细胞吞噬细菌和杀灭肿瘤细胞，调控炎症因子的表达，进而促进巨噬细胞的M1型极化[16]；M2型巨噬细胞表面表达CD163、CD206、Dectin-1等分子[17]，不产生NO，但高表达精氨酸酶-1(Arginase-1)，Arginase-1代谢生成的鸟氨酸、脯氨酸可以促进胶原合成和组织重构[18]，降低炎症反应。

本研究利用GM-CSF成功诱导得到高表达MHC-II类分子的M1型BMDM，并用体外实验证实DEX能促进M1型BMDM向M2型分化。体内实验进一步研究发现：RSV感染小鼠7 d后，其肺泡巨噬细胞主要表达IL-12、IL-6和iNOS，并高表达IRF5转录因子，主要向M1型分化；而注射DEX的小鼠，其肺泡巨噬细胞主要表达IL-10、Arginase-1等，并高表达IRF4转录因子，主要向M2型分化。本实验结果表明，RSV感染后，小鼠肺泡巨噬细胞向M1型分化，促进炎症反应的发生，应用DEX可将M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，抑制炎症反应，这可能是DEX治疗RSV感染的作用机制之一，本研究为RSV感染的治疗提供了新的思路和启示。

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(编校：吴茜)

Influence of dexamethasone on alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus infected mice

HUANG Qian1, WANG Li2, LI Xiao-nan3Δ

(1.Hubei Research Institute of Sports Science, Wuhan 430205, China; 2.Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China;3.Department of Respiratory Medicine, Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430074, China)

ObjectiveTo observe the influence of dexamethasone on M1 BMDM and alveolar macrophage differentiation in respiratory syncytial virus (RSV) infected mice. MethodsCulture M1 BMDM and identify its phenotype, observe the effect of DEX on its transcription factors and cytokines; In RSV infected mice, observe the influence of DEX on the transcription factors and cytokines of alveolar macrophage. ResultsDEX can inhibit IL-6, IL-12, iNOS and IRF5 expression, but promote IL-10, Arginase-1 and IRF4 expression in M1 BMDM and alveolar macrophages of RSV infected mice, made M1 macrophages transform to M2 macrophages. ConclusionDEX can transform M1 macrophages to M2 macrophages in vivo and in vitro, and inhibit inflammation, this may be one of the mechanism of DEX in the treatment of RSV infection.

dexamethasone; respiratory syncytial virus; macrophage

湖北省自然科学基金(2015CFB621)

黄茜，女，医学硕士，研究方向：大众健康，E-mail：huangqian9816@163.com；李晓南，通信作者，女，医学学士，副主任医师，研究方向：呼吸内科感染性疾病的治疗，E-mail：19761073@qq.com。

R392.5

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