乙醇水溶液提取樟树叶活性成分工艺及其成分分析1)

刘泽旭　徐国祺　王立海

(森林持续经营与环境微生物黑龙江省重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)



乙醇水溶液提取樟树叶活性成分工艺及其成分分析1)

刘泽旭徐国祺王立海

(森林持续经营与环境微生物黑龙江省重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

摘要以樟树叶提取率为响应值，采用单因素试验和响应面法对提取时间、提取温度、液料比和乙醇体积分数4个影响因素进行优化选择，确定最优工艺参数；而后利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法对所得提取物进行成分分析。结果表明：各因素对樟树叶提取率的影响由大到小依次为液料比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数，其中液料比属极显著影响因素；樟树叶提取最优工艺参数为乙醇体积分数45%，提取温度58 ℃，提取时间78 min，液料比16(mL)∶1(g )，平均提取率达到19.33%；提取的樟树叶提取物中含有大量醇烯化合物，其中异丁香酚甲醚(18.42%)、芳樟醇(11.59%)、反式-橙花叔醇(10.40%)、丁香酚甲醚(6.37%)等都是经济价值较高的化合物。

关键词樟树叶；樟树叶活性成分；提取工艺参数

樟树是樟科樟属植物，属常绿乔木，分布于台湾及华东南部等长江流域以南地区，生长在亚热带土壤肥沃的向阳山坡、谷地及河岸平地[1]。研究表明，樟树叶中富含樟脑和芳樟醇等物质，因而樟树叶被广泛应用于香精香料、医药、化工、食品和烟草等工业[2]。

马英姿等[3]研究发现，樟树叶精油对大肠杆菌等4种菌种具有较好的抑菌效果，但樟树鲜叶和落叶提取率仅为0.46%和0.52%；徐国祺[4]发现，樟树叶水提取物复配试剂可以明显增强竹材的防霉耐腐性能，但微波提取樟树叶提取物的平均提取率为2.514%；Yeh et al.[5]研究发现，樟树叶和枝水提取物能提高南美白对虾的抗病能力，但叶与枝水提物的提取率分别为1.15%和0.6%；李权[6]研究发现，樟树叶木质部甲醇提取物对木材腐朽菌有很好的抑制效果，而且超声波—微波协同提取樟树叶木质部提取物的提取率最高为4.65%。虽然樟树叶提取物有着广阔的研究前景，但其提取率低，将影响其日后的推广和应用。

樟树叶提取方法主要有微波辅助提取法、超临界CO2法和水浴搅拌等方法[4]。微波辅助提取法具有操作简便、省时迅速以及提取物质纯度高等优点，但其试验设备昂贵，提取成本高，使其不能在生产方面得到普及[7]。超临界CO2法具有无毒、无味、不可燃，产品无有机溶剂残留，提取效率高等优点[8-9]，但其存在提取成本高以及提取率低等问题[4]。水浴搅拌法具有操作方便、试验条件要求低、成本低和提取率高等优点[10]。

本研究以樟树叶提取率为响应值，采用单因素试验和响应面法对其水浴搅拌提取工艺进行优化，得到了樟树叶的最优工艺参数，而后利用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱法对最优条件下的提取物进行成分分析，为樟树叶提取物的深入研究提供了科学依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

樟树叶2013年春季采自中南林业科技大学植物园。选取表面状态良好的叶子随机采自于不同的香樟树(Cinnamomum camphora (Linn.) Presl)，均匀混合。将樟树叶放置于室内阴凉干燥处阴干，而后利用高速离心粉碎机研磨成过40～60筛子的粉末，收集樟树叶粉末置于干燥培养皿中密封备用。

仪器：无水乙醇(分析纯，天津市天理化学试剂有限公司)，蒸馏水；数显恒温水浴锅(HH-4型，国华电器有限公司)；旋转蒸发仪(RE52AA型，上海亚荣生化仪器)；高速离心粉碎机(Q-250A3型，上海冰都电器有限公司)；电子分析天平(0.1 mg)(FA2001N型，郑州时代仪器设备有限公司)；搅拌器(DK-98-IIA型，天津市泰斯特仪器有限公司)；气相色谱-质谱联用仪(Agilent6890N型，美国Agilent公司)；PDMS固相萃取萃取头(57318型，上海哈姆仪器技术有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1提取工艺的单因素试验

水浴搅拌提取过程中主要的试验因素为提取时间、提取温度、液料比和乙醇体积分数。对这4个因素分别进行单因素试验[11]，各因素单因素试验设计见表1。

表1　单因素试验设计

注：由于温度过高会使樟树叶部分化学成分大量挥发[4]，故提取温度最高取65 ℃；当测定某一变量对提取率的影响时，其他条件始终保持不变；各变量的定值为提取时间60 min，提取温度50 ℃，液料比12 mL∶1 g，乙醇体积分数40%。

1.2.2提取工艺的响应面优化试验

根据先前单因素试验的结果，以提取率作为响应变量，对4个影响因素，提取时间、提取温度、液料比与乙醇体积分数，进行四因素三水平的响应面优化试验[12-13]，各因素水平见表2。

表2　响应面优化试验因素与水平

1.2.3樟树叶提取率计算

利用电子天平称取20 g樟树叶粉末，放置于500 mL锥形瓶中，按照先前试验要求调节各个因素，进行水浴搅拌提取。用真空泵和布氏漏斗抽取滤液，将滤液放置于已称质量的旋转蒸发瓶中，进行旋转蒸发(水浴温度为40 ℃)，待旋蒸至质量恒定，称取蒸发瓶与剩余物的总质量[10]。樟树叶提取率的计算公式如下：

W=(m2-m1)/m0。

式中：W表示提取率(%)；m0表示樟树叶粉末质量(g)；m1表示旋转蒸发瓶质量(g)；m2表示蒸发瓶与剩余物总质量(g)。

1.2.4优化工艺验证

根据先前单因素试验和响应面优化试验确定的最优工艺参数，进行3次樟树叶提取，计算提取率平均值和相对误差，验证响应面的优化结果，比较两种优化结果提取率的差异，相对误差计算公式如下：

相对误差=|y2-y1|/y1。

式中：y1表示提取率的预测值；y2表示提取率的实际值。

1.2.5顶空固相微萃取—气相色谱—质谱检测方法

依据先前确定的最佳提取条件对樟树叶进行提取，取1 g所得提取物，采用顶空固相微萃取技术进行预处理。顶空固相微萃取条件：在80 ℃下萃取60 min，在进样口热解析2 min。

气相色谱条件：色谱柱为Agilent公司生产的19091Z-433 HP-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，载气为氦气。色谱柱程升条件为初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1的速度升至100 ℃，再以20 ℃·min-1的速度升至250 ℃，保持10 min，分流比为50∶1。

质谱条件：电离方式为电子轰击源(EI)，电子能量为70 eV，离子源温度230 ℃，扫描质量范围为20-680 m/z。

2结果与分析

2.1单因素试验

提取温度对提取率的影响：当其他条件一定，提取温度分别为45、50、55、60、65 ℃时，樟树叶的提取率分别为15.71%、15.07%、17.59%、16.98%和13.83%。说明随着温度升高，樟树叶提取率先增大后减小。温度在55 ℃以下，提取率总体呈上升趋势。温度在55 ℃以上，提取率随温度的升高而逐渐减小。这是由于樟树叶提取物中含有樟脑等挥发性物质，这些物质的挥发性会随着温度的升高而增强[1，4]，所以温度较高时提取率不仅不会增加反而会减小。综上所述，提取温度以55 ℃为宜。

提取时间对提取率的影响：当其他条件一定，提取时间分别为50、60、70、80、90 min时，樟树叶的提取率分别为14.18%、14.94%、17.85%、14.21%和14.17%。说明随着提取时间的增加，樟树叶提取率呈现出先增大后减小的变化趋势。提取时间从50 min增加到70 min，提取率由14.18%提高到17.85%。而70 min以后，提取率随着提取时间的增长而下降。说明提取时间以70 min为最佳。

液料比对提取率的影响：当其他条件一定，液料比(mL∶g)分别为10∶1、12∶1、14∶1、16∶1和18∶1时，提取率分别为12.23%、14.36%、19.06%、17.99%和13.72%。说明液料比由10 mL∶1 g增加到14 mL∶1 g的过程中，樟树叶提取率逐渐增加，由12.23%提高到19.06%。液料比大于14 mL∶1 g之后，提取率随着液料比的增加而减小。说明液料比以14 mL∶1 g为最佳。

乙醇体积分数对提取率的影响：当其他条件一定，乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%和60%时，提取率分别为12.37%、13.37%、13.55%、18.51%和9.54%。说明乙醇体积分数由20%升高到50%的过程中，樟树叶的提取率逐渐增加，从12.37%提高到18.51%。乙醇体积分数从50%增加到60%的过程中，提取率迅速下降。说明乙醇体积分数以50%为最佳。

2.2响应面试验设计

应用Design-Expert 8.05软件，采用Box-Benhnken进行试验设计，对乙醇体积分数、提取温度、提取时间和液料比4个单因素进行分析并得到试验方案及结果(表3)。对表3中试验数据进行分析，得到结果如表4所示。以樟树叶提取率为响应值y，经回归拟合后得到回归方程：

y=16.76-0.079A-0.093B-0.32C+1.34D-0.29AB-

0.098AC-0.56AD+0.77BC+0.82BD+0.95CD-0.72A2-

0.42B2+0.39C2-0.31D2。

由表4可知，上述回归方程的R2=0.886 2，该模型的F值为7.79，P值为0.000 2<0.01(极显著)，而失拟项P值为0.796 7>0.05(不显著)。说明该回归方程能较好地描述各个因素与响应值之间的关系，可利用该方程确定樟树叶提取率的最佳提取工艺。

由表4可看出，各因素中一次项液料比(D)为极显著影响因素，交互项提取时间和液料比(CD)为极显著影响因素，交互项提取温度和提取时间(BC)与交互项提取时间和液料比(CD)为显著影响因素，二次项乙醇体积分数和乙醇体积分数A2为极显著影响因素。说明各因素与响应值不是简单的线性关系。由对提取率的回归系数检验值F可知，各因素对樟树叶提取率的影响由大到大小依次为液料比(D)、提取时间(C)、提取温度(B)、乙醇体积分数(A)。

表3　响应面试验设计及结果

表4　方差分析

注：** 表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)。

根据回归方程作出各因素交互作用的响应曲面图(图1)。由图1可知，提取温度(B)和提取时间(C)、提取温度(B)和液料比(D)以及提取时间(C)与液料比(D)的交互影响显著，它们都表现为曲线图陡峭，等高线密集，这与方差分析结果相一致。

图1　双因素交互作用对樟树叶提取率的响应面图

2.3工艺优化与验证

以单因素试验所得结果确定的最优工艺参数为乙醇体积分数50%，提取温度55 ℃，提取时间70 min，液料比14 mL∶1 g。进行三次重复验证试验，所得提取率分别为16.54%、16.60%和16.76%。计算可知此条件下提取率平均值为16.63%。

应用Design-Expert 8.05软件，根据得到的回归方程，算得樟树叶提取的最优工艺参数为乙醇体积分数45.39%，提取温度为58.47 ℃，提取时间78.31 min，液料比15.92 mL∶1 g，预测提取率为19.49%。为了便于试验操作，乙醇体积分数取45%，提取温度取58 ℃，提取时间取78 min，液料比取16 mL∶1 g。进行三次重复验证试验，所得结果如表5所示。由表5可知，三次的提取率相对误差均小于2%，平均提取率相对误差值小于1%，说明提取率预测值合理可靠。相对于单因素试验所确定的最优工艺参数，其提取率相对提高了17.20%。

表5　响应面优化工艺的提取率与相对误差

响应面法是将响应受多个变量影响的问题进行建模和分析并以此来优化响应的一种回归分析方法[12]，[14]1-10。它具有试验次数少，周期短，建立的回归方程精度高等优点[15-16]，还能通过直观地图形分析各个因素之间的交互作用[11，17-18]。而单因素试验只能单独分析各个变量与响应值的关系，不能分析各个因素的交互性对响应值的影响，使其所得到的优化值存在一定的局限性[19-20]。本研究表明，在单因素试验所确定的最佳提取工艺条件下，提取率平均值为16.63%。而在响应面法所确定的最佳提取工艺条件下，提取率预测值为19.49%，其相对误差小，合理可靠。相对于单因素试验，其提取率相对提高了17.20%，说明响应面法能更好地优化樟树叶提取工艺。

2.4提取物成分分析

利用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对樟树叶提取物化学成分进行检测，总离子流图中出现了45个峰，通过标准库对照分析，鉴定出39种化学成分，占提取物化合物质量分数的96.79%，各化学成分质量分数如表6所示。

表6　樟树叶提取物化学成分的GC-MS分析结果

由表6可知，樟树叶乙醇水溶液提取物中含有大量醇烯化合物，其中异丁香酚甲醚(18.42%)、芳樟醇(11.59%)、反式-橙花叔醇(10.40%)、环丁烷甲酸-十三碳-2-炔基酯(9.20%)、丁香酚甲醚(6.37%)、桉油烯醇(5.03%)、6-芹子烯-4醇(3.81%)、1-石竹烯(3.66%)、松油醇(3.35%)、a-芹子烯(3.25%)、α-石竹烯(2.60%)和1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-环丙基)-环己烯(2.54%)等，共占樟树叶提取物化学成分质量分数的80.22%。

异丁香酚甲醚为中国GB2760-1996规定允许使用的食用香料，其主要用于配制香精和香料[21-22]。研究表明，芳樟醇具有特殊的香气而被用于香料香精的制造，它还具有抗菌、抗病毒和镇静等作用而被用于医疗保健[23]。反式橙花叔醇又名反式苦橙油醇，为降香油的主要成分，降香是我国传统名贵中药，具有行气活血和止血等功效[24-25]。丁香酚甲醚具有丁香和康乃馨的香气，常用于配制香精，它还作为多种果蝇的诱惑剂，且在医学上有镇咳、祛痰、镇静、镇痛功能[26]。由樟树叶提取物成分分析结果表明，最优条件下提取的樟树叶提取物中含有以上化学成分的含量都相对较高。且这些化学成分人工合成程序复杂，合成成本较高。说明樟树叶乙醇水提取物具有较高的经济价值和较好的研究前景。

3结论与讨论

在提取过程中，溶剂浸润物料，渗入植物组织和细胞中，溶解组织中的活性成分，使其游离于组织或细胞，此时，由于细胞内外有效成分存在浓度差，形成内高外低的渗透压，使有效成分向组织或细胞外扩散。在不破坏活性成分的温度内，提取温度越高，活性成分运动速度越快，扩散作用的速度越快，提取速率也越快，进而影响提取率的大小。而活性成分在乙醇水溶液中的溶解度是一定的，随着液料比的增大，溶液所能溶解的活性成分就越多，进而影响提取率的大小。在提取过程中，搅拌使固液两相的接触面积增大、边界层更新快[27]。故提取时间越长，搅拌时间越长，固液两相的接触越充分，提取效果越好。

一般有机化合物的极性较小，大多数有机化合物在水中的溶解度都很小，但它们易溶于极性小的有机溶剂。而乙醇水溶液的极性介于水和乙醇之间。乙醇体积分数的改变使其极性发生变化，从而影响活性成分的溶解性，导致提取率发生变化[5]，[14]11-15。

本研究通过对樟树叶乙醇水溶液提取工艺优化及其成分分析得出结论，樟树叶最优工艺参数为乙醇体积分数45%，提取温度58 ℃，提取时间78 min，液料比16 mL∶1 g，平均提取率达到19.33%。各因素对樟树叶提取率的影响由大到小依次为液料比(D)、提取时间(C)、提取温度(B)、乙醇体积分数(A)，其中D属极显著影响因素；最优条件下提取的樟树叶提取物中含有大量醇烯化合物，其中异丁香酚甲醚、芳樟醇、反式-橙花叔醇、丁香酚甲醚等都是经济价值较高的化合物。说明该方法下得到的樟树叶乙醇水提取物具有较高的经济价值和较好的研究前景。

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第一作者简介：刘泽旭，男，1990年1月生，森林持续经营与环境微生物黑龙江省重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail:1127844691@qq.com。 通信作者：王立海，森林持续经营与环境微生物黑龙江省重点实验室(东北林业大学)，教授。E-mail:wanglihai2012@126.com。

收稿日期：2015年9月8日。

分类号S718.43

Extraction Technology of Cinnamomum camphora Leaves through Stirring and Its Compounds//

Liu Zexu, Xu Guoqi, Wang Lihai(Key Laboratory of Sustainable Forest Management & Environmental Microbiology in Heilongjiang Province, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：34-39.

For the optimum extraction technology and compound in the extraction of camphor leaves, we used response surface method and single-factor experiments method to optimize the extraction techniques of camphor leaves.Extraction time, extraction temperature, liquid-material ratio and ethanol concentration were served as independent variables while the extraction rate of camphor leaves was served as the dependent variable.We applied the HS-SPME coupled with GC-MS method to analyze the compounds in the extraction under the optimal parameters.The sequence of every factor for the extraction rate was liquid-material ratio, extraction time, extraction temperature and ethanol concentration.Liquid-material ratio was the extremely significant factor.The optimal extraction parameters of extraction rate of camphor leaves were ethanol concentration of 45%, liquid-material ratio of 16∶1(mL·g-1), extraction temperature of 58 ℃ and extraction time of 78 min.Under the optimal parameters, the average extraction rate of camphor leaves was 19.33%.The camphor leaves ethanol-water extraction, under the optimal parameters, contain plenty of alfin compounds including Methyl isoeugenol (18.42%), Linalool (11.59%), Nerolidol (10.40%), and Methyl eugenol (6.37%) et al., which had high economic value.

KeywordsCamphor leaves; Activity compounds of camphor leaves; Extraction parameters

1)教育部博士点基金项目(20130062110001)。

责任编辑：任俐。